Zahlreiche neu-synthetisierte Proteine benötigen für ihre korrekte Faltung die Beteiligung spezieller Helferproteine, die als molekulare Chaperone bezeichnet werden und sowohl ko- als auch posttranslational wirken. Mitglieder der Hsp70 Klasse binden und stabilisieren an die wachsende Polypeptidkette während der Translation und verhindern dadurch Fehlfaltungen und Aggregation. Darüberhinaus benötigen viele Proteine für ihre vollständige Faltung weitere Faltungshelfer wie z.B. die Chaperonine. Hierbei handelt es sich um große, zylindrische Komplexe, in deren Innern die Faltung von Substraten abgeschirmt von äußeren Einflüssen erfolgt.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht das Chaperonin TRiC des eukaryotischen Zytosols. Dieser hetero-oligomere Komplex setzt sich aus zwei übereinander gelagerten Ringen zusammen, die jeweils eine Faltungshöhle umschließen und aus 8 verschiedenen Untereinheiten gebildet werden. Ursprünglich wurde angenommen, dass es sich bei TRiC um ein hoch spezialisiertes Chaperonin handelt, das ausschließlich für die Faltung der Zytoskelettproteine Aktin und Tubuline benötigt wird. Mittlerweile konnte aber eine Beteiligung von TRiC auch an der Faltung anderer Substrate nachgewiesen werden, so beispielsweise einer Reihe von Proteinen mit WD-repeat Propeller-Motiven. Für die effiziente Faltung von Substraten benötigt TRiC das Zusammenspiel mit anderen Chaperonen. Während bei der Faltung von Aktin und Tubulinen TRiC eng mit dem Ko-Chaperon GimC/Prefoldin kooperiert, ist das Hsp70 Chaperon Ssb1/2p an der TRiC-vermittelten Faltung von Substraten mit WD-repeats beteiligt. Bislang war unverstanden, auf welche Art und Weise diese Chaperone miteinander interagieren und wie Substrate erkannt werden.
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Protokolls zur Reinigung von TRiC im Großmaßstab aus S. cerevisiae sowie die Verwendung des gereinigten Komplexes für funktionelle in vitro Studien, anhand derer die TRiC-vermittelte Faltung verschiedener Substrate näher untersucht wurde. Da TRiC in Hefezellen nur in geringen Mengen vorhanden ist, wurden anfangs unterschiedliche Strategien zur Reinigung ausreichender Mengen funktioneller Chaperonin-Komplexe verfolgt. Hierbei erwies sich die Epitop-Markierung einer Untereinheit mit einem Histidin-tag bei gleichzeitiger Überproduktion aller Untereinheiten als erfolgreich. Die Epitop-Markierung interferierte weder mit der Komplexassemblierung noch beeinflusste sie die Funktionalität des Chaperonins. Durch Verwendung einer Ni2+-Affinititätsmatrix sowie drei weiterer chromatographischer Reinigungsschritte wurde der funktionelle Komplex zu einem hohen Reinheitsgrad aus Hefelysat isoliert.
Für funktionelle Studien wurde der gereinigte Komplex in einem isolierten System untersucht. Hierzu wurden mittels eines prokaryotischen in vitro Transkriptions / Translationssystems TRiC-Substrate (Aktin, Tubuline) in vitro synthetisiert und deren de novo Faltung in An- oder Abwesenheit von gereinigtem TRiC und weiterer gereinigter, eukaryotischer Chaperone (GimC, bzw. Ssb1p) analysiert. Zusätzlich wurde die Faltung bislang kaum charakterisierter Substrate, die zur Strukturklasse der WD-repeat Proteine gehören, näher untersucht. Die Faltung in vitro synthetisierter Substrate wurde über Zunahme der Löslichkeit verfolgt, da fehlgefaltete Proteine zur Aggregation neigen. Zusätzlich wurden Substrat-spezifische Faltungstests entwickelt, die auf der Interaktion des neu-synthetisierten Polypeptids mit einem Partnerprotein basieren und direkt Aufschluss über den Faltungszustand geben. Mit Hilfe dieser in vitro Faltungstests konnte der Einfluss der individuellen Chaperone auf den Faltungsprozess der verschiedenen Substrate direkt analysiert werden. Hierdurch konnten frühere in vivo Beobachtungen bestätigt werden demzufolge akzessorische Chaperone wie GimC oder das Hsp70 Chaperon Ssb1/2p vornehmlich die Aggregation neu-synthetisierter Proteine verhindern, während der eigentlich Faltungsprozess durch TRiC vermittelt wird. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass mit den in dieser Arbeit entwickelten in vitro Faltungstests eine geeignete Methode zur Verfügung steht, mit deren Hilfe sich zukünftig neue potentielle TRiC Substrate identifizieren lassen.
Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
