Quantitative histochemische und immunhistochemische Darstellung der Succinatdehydrogenaseaktivität und der Proteinuntereinheiten in Herz und Lunge der Ratte
Sauerstoff ist ein essenzielles Substrat für alle Säugetierzellen. Die Mechanismen der zellulären Sauerstoffmessung sind bislang noch nicht vollständig geklärt. In der hypoxie-abhängigen Regulation der Gentranskription spielen Prolylhydroxylasen eine entscheidende Rolle, bei der Einleitung der hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion sind hingegen andere Mechanismen aktiv. Als einer der hierbei beteiligten Kandidaten gilt Komplex II der mitochondrialen Atmungskette (Synonym: Succinatdehydrogenase = SDH). Frühere Arbeiten zeigten, dass SDH-Aktivität nicht ubiquitär in Mitochondrien nachweisbar ist. Sie fehlt beispielsweise in axonalen Endigungen und in einzelnen Zelltypen der Lunge. Ein erster Schritt in der Klärung der Fragestellung der Beteiligung der SDH an Sauerstoffsensormechanismen ist daher die Untersuchung von Zellen verschiedener Systeme auf das Vorhandensein von Komplex II. Ziel dieser Arbeit war es, Gewebe von Herz und Lunge der Ratte auf das Vorhandensein von SDH sowie die Untereinheitenverteilung des Enzyms innerhalb der einzelnen Gewebe zu untersuchen. Des Weiteren sollte geklärt werden, ob die SDH-enthaltenden Zellen eine zur Proteinmenge korrelierende, histochemisch nachweisbare Enzymaktivität zeigen und ob die Mitochondrienmenge einer Zelle mit dem SDH-Gehalt korreliert.Der Proteingehalt an SDH-Untereinheiten wurde mittels quantitativer Immunfluoreszenz und die SDH-Enzymaktivität mittels quantitativer Histochemie bestimmt. Für die immunhistochemische Darstellung wurden Antikörper gegen die einzelnen SDH-Untereinheiten A, B, C und D durch Immunisierung von Kaninchen und Meerschweinchen hergestellt. Diesem folgte die Entwicklung eines optimierten Inkubationsprotokolls, das für die gesamte Untersuchung genutzt wurde. Des Weiteren wurde zum Vergleich ein kommerziell erhältlicher monoklonaler Antikörper gegen die Untereinheit B eingesetzt. Zur Bestimmung der Mitochondrienmenge wurde der Komplex V immunhistochemisch bestimmt. Die glatte Muskulatur wurde mit einem Antikörper gegen alpha-Smooth muscle actin identifiziert. Durch die Immunisierung mit für die einzelnen Untereinheiten spezifischen Peptidsequenzen und Affinitätsreinigung konnten immunhistochemisch nutzbare Antikörper für die SDH-Untereinheiten A, B und C generiert werden. Für die erfolgreiche immunhistochemische Darstellung war eine Mikrowellenbehandlung der Schnitte erforderlich. Der SDHD-Antikörper konnte hingegen auf Grund mangelnder Spezifität nicht zur weiteren Auswertung genutzt werden. Es zeigte sich, dass alle Zellen der untersuchten Gewebe SDH enthielten. Insbesondere gilt dies auch entgegen früherer Arbeiten für die kleinen Lungenarterien und die Alveolarsepten. Grundsätzlich waren die immunhistochemisch detektierbaren SDH-Untereinheiten innerhalb eines Gewebes quantitativ gleichermaßen vertreten. Auch die immunhistochemisch bestimmte Enzymmenge und die histochemisch bestimmte Enzymaktivität korrelierten bis auf die Ausnahmen beim Bronchialepithel, den Alveolarsepten und der glatten Muskulatur der kleinen Bronchi (< 100 µm).Beim Vergleich der SDH-Markierungsintensität mit der des Komplex V zeigten sich gewebespezifische Unterschiede, die für zelltypspezifische Unterschiede in der Zusammensetzung der Atmungskettenkomplexe sprechen. Besonders deutlich zeigte sich dies im plurivakuolären Fettgewebe, in dem die oxidative Phosphorylierung entkoppelt ist und dementsprechend eine proportional minimale Komplex V-Menge immunhistochemisch nachgewiesen werden konnte.In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Zelltypen in Herz und Lunge SDH enthalten, wenn auch in gewebespezifischem Verhältnis zu Komplex V. Weiterhin sprechen die vorliegenden Ergebnisse für eine koregulierte Expression von SDH-Untereinheiten innerhalb einer Zelle. Dies gilt insbesondere auch für die kleinen Lungenarterien, in denen in früheren histochemischen Arbeiten keine SDH-Aktivität nachgewiesen wurde, aufgrund funktioneller Daten jedoch eine Beteiligung der SDH am Sauerstoffsensormechanismus angenommen wurde.
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