Einfluss der Monozytentransmigration über pulmonales Kapillarendothel und Alveolarepithel in vitro auf die monozytäre Zytokinproduktion

Abstract

Bei der entzündungsgetriebenen Rekrutierung in den Alveolarraum überqueren die im Blutgefäßsystem zirkulierenden mononukleären Phagozyten die pulmonale Kapillarendothel- und Alveolarepithelbarriere. Ein durch die pulmonale Inflammation getriggerter chemotaktisch wirksamer MCP1/CCL2 Gradient ist an der Monozytentransmigration maßgeblich beteiligt. Auf dem Weg in den Alveolarraum kommt es zu einer Aktivierung der Monozyten im Sinne einer inflammatorischen Monozytenmodulation. Zell-Zell- Interaktionen, wie die Monozytenadhäsion an pulmonalem Endo- bzw. Epithel sowie der Einfluss löslicher Faktoren können hierzu beitragen. Um die transmigrationsassoziierte Funktionsänderung humaner Monozyten näher zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit sowohl die Monozytenadhärenz an Endo- bzw. Epithelzellen als auch der Transmigrationsvorgang durch die endo-/epitheliale Barriere in einem in vitro Modell imitiert. Die Monozyten transmigrierten in Anwesenheit eines MCP-1/CCL2 Gradienten über physiologisch angeordnete HMVEC-L Endothel- und A549 Epithelbarrieren. Die dabei verwendeten Transwells waren mit konfluenten endo-/epithelialen Einzelzellschichten kultiviert, ebenso die Kulturplatten für die Adhärenzansätze. Die Vitalität und das Apoptoseverhalten der Monozyten in den verschiedenen Transwellkompartimenten wurden durchflusszytometrisch evaluiert. Im Anschluss an die Transmigration bzw. Adhärenz über 4 Stunden wurden die migrierten Monozyten über 16 Stunden in vitro kultiviert und die in diesem Zeitraum liberierten proinflammatorischen Zytokine IL-1b und TNF-a sowie in einigen Ansätzen IL-6 und IL-8 in den Kulturüberständen mit Hilfe der ELISA-Technik quantifiziert. Darüber hinaus wurde die intrazelluläre IL-1b - Konzentration direkt nach Transmigration bzw. Adhärenz mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestimmt. Die MCP-1/CCL2 getriebene in vitro Transmigration von Monozyten durch den endo-/ epithelialen Bilayer induzierte die proinflammatorischen Zytokine IL-1b, TNF-a, IL-6 sowie IL-8 in den transmigrierten mononukleären Phagozyten. Eine inflammatorisch veränderte Endo-/Epithelbarriere, die durch Vorstimulation des Bilayers mit IL-1b imitiert wurde, verstärkte die monozytäre IL-1b- / TNF-a - Liberierung nach Transmigration im Vergleich zu unstimulierten Barrieren.Auch die MCP-1/CCL2 getriebene Transmigration über Endothel-/Epithelmonolayer induzierte die Synthese proinflammatorischer Zytokine in Monozyten, allerdings in der Regel in geringerem Ausmaß als im Bilayersystem. Insbesondere die Steigerung der Zytokinsekretion bei Migration über inflammatorisch veränderte Barrieren, imitiert durch IL-1b-Vorstimulation der Endo- bzw. Epithelmonolayer, war im Monolayermodell deutlich geringer ausgeprägt als im Bilayermodell.Zwar induzierte bereits die Adhärenz von Monozyten an Endo- oder Epithelzellen ohne nachfolgende Transmigration eine erhöhte Synthese der Zytokine IL-1b und TNF-a (Ausnahme: Adhärenz an A549 führte nicht zur TNF-a - Induktion). Diese adhärenzinduzierte Zytokininduktion war jedoch deutlich geringer ausgeprägt als die durch Transmigration ausgelöste Zytokinfreisetzung. Eine Ausnahme hierbei bildete die Adhärenz an mikrovaskulären Zellen, die eine mit der Transmigration vergleichbare IL-1b - Induktion auslöste. Auch nach IL-1b-Vorstimulation der Zellbarrieren induzierte die Transmigration eine deutlich höhere IL-1b - Produktion in Monozyten als die Adhärenz. Umgekehrt synthetisierten Monozyten nach Adhärenz an IL-1b-vorstimulierten endo- bzw. epithelialen Monolayern mehr TNF-a als nach Transmigration. Auch die intrazelluläre Zytokinmessung unmittelbar nach Transmigration zeigte eine höhere monozytäre Interleukin-1b - Induktion nach Transmigration im Vergleich zur Adhärenz sowohl bei stimulierten als auch unstimulierten Endo- und Epithelzellen. Damit werden die Ergebnisse der Zytokinmessung im Kulturüberstand mittels ELISA-Technik durch eine zweite kulturunabhängige Methode bestätigt.Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass inflammatorisch rekrutierte Monozyten und hieraus differenzierende Alveolarmakrophagen die pulmonale Entzündung durch Zytokinfreisetzung, die durch Interaktion mit pulmonalem Endothel und Epithel im Transmigrationsprozess induziert wird, erheblich beeinflussen können. Es konnte gezeigt werden, dass die monozytäre Zytokinsynthese quantitativ und qualitativ abhängig von Zell-Zell-Kontakten mit Endothel und Epithel differiert. Die Ergebnisse sind weitere Bausteine zur Entwicklung pathophysiologisch fundierter Therapiekonzepte des akuten Lungenversagens. Recruitment of PBMCs into the alveolar space of the lung driven by inflammation is characterized by monocyte transmigration across the pulmonal capillary endothelial and epithelial barrier. A chemotactic effective MCP-1/CCL-2 gradient triggered by pulmonal inflammation is essentially involved in monocyte transmigration. On its way to the alveolar space an activation of monocytes can be observed within the means of an inflammatory modulation. Cell-cell interactions like monocyte adhesion to pulmonal endo-/epithelium as well as the influx of soluble factors may contribute to this modulation.To investigate the transmigration-associated modulation of human monocytes we imitated the monocyte adhesion to endo-/epithelial cells as well as the transmigration process in an in vitro model. Monocytes transmigrated through physiological directed HMVEC-L endothelial / A549 epithelial barriers in presence of an MCP-1/CCL-2 gradient. For this we used transwells covered with confluent endo-/epithelial monolayers, also culture plates used for adhesion experiments. Vitality and apoptotic behavior of monocytes in the different transwell compartments have been evaluated by flow cytometric analysis. Following a 4- hour adhesion- / transmigration process, migrated monocytes were cultivated for 16 hours. Supernatants containing the liberated proinflammatoric cytokines IL-1b, TNF-a in few trials IL-6 and IL-8 during this period were quantified applying ELISA-technique. Furthermore intracellular IL-1b concentration has been determined straight after Transmigration/Adhesion procedure.MCP-1/CCL-2 derived monocyte transmigration in vitro through endo-/epithelial bilayer induced the proinflammatoric cytokines IL-1b, TNF-a, IL-6 and IL-8 in transmigrated mononuclear phagocytes. An inflammatory influenced endo-/epithelial barrier imitated by pre-stimulation of the bilayer with IL-1b enhances monocytotic liberation of IL-1b/TNF-a after transmigration compared with unstimulated barriers. Also CCL2 driven transmigration through endo-/epithelial monolayers induced synthesis of proinflammatoric cytokines in monocytes, however usually by minor scale compared with the bilayer model. In particular the increased liberation of cytokines in monocytes migrating through IL-1b pre-stimulated endo- and epithelial monolayers was clearly found on a minor extend compared with a pre-stimulated bilayer. Though adherence to endo-/epithelial cells without following transmigration already induced an augmented synthesis of IL-1b and TNF-a this cytokine induction however was found on a lower level than the transmigration-triggered cytokine-liberation. An exception was the adherence to endothelium which showed a comparable extend of IL-1b induction. Even after IL-1b pre-stimulation of the barriers transmigration induced a higher IL-1b production in monocytes compared with adherence. Vice versa monocytes synthesized more TNF-a after endo-/epithelial adhesion than after transmigration.Also intracellular concentration of IL-1b in monocytes directly after transmigration revealed a higher induction of this cytokine compared with adherence in both native and pre-stimulated endo-/epithelial cells. This intracellular measurement represents a second cell-culture independent method to confirm the results of the liberated IL-1b in supernatants by ELISA-technique.In conclusion these results point to a considerable contribution of inflammatorically recruited monocytes / alveolar macrophages to pulmonal inflammation initiated by cytokine liberation triggered by interaction with pulmonal endothelium and epithelium within the transmigration process. We pointed out that cytokine synthesis of monocytes depends on cell-cell interaction with endothelium and epithelium quantitatively as well as qualitatively. These findings could be seen as a further contribution to develop pathophysiologically founded therapeutic concepts for treatment of acute lung failure.