Das pflanzliche Polyphenol Resveratrol, kommt unter anderem in Rotwein, Weintrauben und Erdnüssen vor und wirkt chemopräventiv. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekularen Mechanismen der Wachstumshemmung durch Resveratrol auf kolorektale Karzinomzellen zu charakterisieren.
Zellkultur: HCT-116 und Caco-2 (kolorektale Karzinomzelllinien)
Zytotoxizität: Laktatdehydrogenasemessung im Überstand
Zellzahl: Kristallviolettfärbung
Proliferation: [3H]-Thymidin- bzw. [14C]-Leucineinbau
Caspase-3 Aktivität: fluorometrischer Enzymassay
Alkalische Phosphataseaktivität: kolorimetrischer Enzymassay
Proteine: Western blot
transformierender Wachstumsfaktors-beta1 (TGF-beta1): ELISA im Überstand
Ornithindecarboxylase (ODC)- und S-Adenosylmethionindecarboxylase (SAMDC)-Aktivität: [14CO2]-Freisetzung aus [14C]-Ornithin bzw. [14C]-S-Adenosylmethionin
mRNA: Polymerasekettenreaktion
Spermidin/Spermin-N1-Acetyltransferase (SSAT)-Aktivität: [3H]-Acetyl-CoA-Transfer auf Spermidin
Intrazelluläre Polyaminkonzentration: HPLC
DNA-Bindungsaktivität von c-Fos und c-Jun: ELISA-basiertes Verfahren
Eine resveratrolinduzierte Wachstumshemmung der Zelllinien Caco-2 und HCT-116 (12,5-200 µM) wurde durch konzentrationsabhängige Hemmung der Proliferation verursacht. Resveratrol verschob die Zellzyklusdistribution zugunsten der S-Phase-Population (am deutlichsten bei 50 µM) parallel zur Reduktion zellzyklusregulierender Proteine (Cyclin D1, cyclinabhängige Kinase (Cdk)4 und p27Kip1). Die Expression der Cycline A und E nahm zu. Der Retinoblastomaproteinspiegel wurde reduziert und bei 200 µM konnte eine Hypophosphorylierung und damit Aktivierung des Proteins detektiert werden. Diese Wirkungen waren spezifisch für Resveratrol, da die Strukturanaloga Rhapontin und Stilbenmethanol keine Alteration der Zellzyklusverteilung bewirkten. Apoptose erfolgte ebenfalls nach Behandlung von Caco-2 Zellen mit Resveratrol (200 µM).
Auch das Resveratrolanalogon Piceatannol wirkte wachstumshemmend auf Caco-2 und HCT-116 Zellen. Die Proliferation von Caco-2 Zellen wurde gehemmt, es konnte jedoch keine differenzierungsfördernde Wirkung verzeichnet werden. Eine Zellzyklushemmung in der S-Phase fand neben einer konzentrationsabhängigen Abnahme der Proteine Cyclin D1, Cyclin B1, Cdk4 und p27Kip1 statt. Die Proteinmenge von Cdk2, Cdk6, Cdc2 und p21Waf1/Cip1 wurde nicht beeinflusst, wohingegen koinzident die Cycline E und A vermehrt exprimiert wurden. Die gleichen Veränderungen der zellzyklusregulierenden Proteine nach Piceatannolbehandlung konnten bei HCT-116 Zellen beobachtet werden.
Im Vergleich war die wachstumshemmende und antiproliferative Wirkung Resveratrols (50 µM) ausgeprägter als die der kurzkettigen Fettsäure Butyrats (2 mM) und ließ sich auch bei gleichzeitiger Gabe beider Substanzen nicht verstärken. Während Resveratrol alleine nicht differenzierungsfördernd wirkte, potenzierte es die butyratinduzierte Differenzierung (Erhöhung der alkalischen Phosphatase-Aktvität und der E-Cadherin-Expression). Die butyratvermittelte p21Waf1/Cip1-Expression wurde erhöht, während p27Kip1 und TGF-beta1 an diesem Differenzierungsvorgang nicht beteiligt zu sein schien.
Auf die Polyaminsynthese in Caco-2 Zellen wirkte Resveratrol inhibitorisch, indem es, ebenso wie Piceatannol die SAMDC- und die ODC-Aktivität hemmte. Beide Stilbene wirkten über Reduktion des ODC-Proteins, jedoch war nur durch Resveratrol eine deutliche odc-mRNA-Abnahme zu verzeichnen. Eine Abnahme des c-Myc-Transkriptionsfaktors, der das odc-Gen positiv reguliert, wurde durch Resveratrol und Piceatannol bewirkt. Die am Polyaminabbau beteiligte SSAT wurde durch Resveratrol, jedoch nicht durch Piceatannol stimuliert. Intrazellulär kam es durch Resveratrol zu einem Anstieg von Putreszin und N8-Acetylspermidin, zweier Marker des Polyaminkatabolismus. Resveratrol führte zu einer Zunahme des c-Fos- und des c-Jun-Proteins. Beide Stilbene induzierten die DNA-Bindungsaktivität von c-Fos, jedoch nicht die von c-Jun.
Die Ergebnisse demonstrieren, dass Resveratrol eine Reihe zellulärer Prozesse in Kolonkarzinomzellen beeinflusst, die schließlich in einer Proliferationshemmung sowie Apoptose der Zellen resultieren. In Kombination mit Butyrat wirkt das Polyphenol dagegen differenzierungsfördernd. Auch das Resveratrolanalogon Piceatannol hemmt die Proliferation. Die vorliegenden Daten weisen darauf hin, dass Resveratrol von pharmakologischem Interesse hinsichtlich der Chemoprävention des Kolonkarzinoms sein könnte.
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