Entwicklung und Anwendung enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis von Cefalexin, Ceftiofur und Desfuroylceftiofur in Milch
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Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und Anwendung enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis der im Hinblick auf die EU-Verordnungen relevanten Cephalosporine Ceftiofur und Cefalexin in Milch.Zur Herstellung immunogener Protein-Konjugate wurde jeweils Cefalexin bzw. Ceftiofur mittels Glutardialdehyd an ein Trägerprotein (KLH) gekoppelt. Jeweils vier Kaninchen wurden mit dem Cefalexin-KLH-Konjugat (1,7 mg/Tier) bzw. dem Ceftiofur-KLH-Konjugat (2,3 mg/Tier) immunisiert. Zur Herstellung von Antigen-Enzymkonjugaten wurden Cefalexin bzw. Ceftiofur mittels Carbodiimid an Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert. Ceftiofur-Proteinkonjugate als Festphasenantigene für den kompetitiven indirekten Enzymimmuntest (EIA) wurden durch Kopplung von Ceftiofur an BSA mittels Carbodiimid bzw. mittels Glutardialdehyd hergestellt.Mit dem Cefalexin-HRP-Konjugat und den verschiedenen Kaninchen-Antiseren wurden kompetitive direkte EIAs erstellt. Es zeigte sich, dass der direkte EIA unter Verwendung gefällter Antiseren als Beschichtung das empfindlichste Testsystem mit einer mittleren Nachweisgrenze für Cefalexin von 0,2 ±± 0,1 µg/kg darstellte (Antiserum Kaninchen 4). Der Nachweis von Cefalexin im kompetitiven direkten EIA unter Verwendung der DASP-Technik erbrachte im Vergleich dazu keine Verbesserung der Testempfindlichkeit. Mit dem Ceftiofur-HRP-Konjugat und den verschiedenen Kaninchen-Antiseren wurden kompetitive direkte EIAs auf Basis der DASP-Technik erstellt. Mit dem Ceftiofur-BSA-Konjugat und den verschiedenen Kaninchen-Antiseren wurden kompetitive indirekte EIAs erstellt. Der indirekte EIA unter Verwendung von Ceftiofur-C-BSA als Beschichtungs-antigen erwies sich als empfindlichstes Testsystem, mit einer mittleren Nachweisgrenze für Ceftiofur von 1,9 ±± 1,0 mg/kg (Antiserum Kaninchen 5) bzw. 3,3 ±± 1,1 müg/kg (Antiserum Kaninchen 6). Zur Bestimmung der Spezifität des kompetitiven direkten EIA zum Nachweis von Cefalexin bzw. des kompetitiven indirekten EIA zum Nachweis von Ceftiofur wurde der Einfluss anderer Cephalosporine sowie strukturähnlicher Penicilline auf die Testsysteme untersucht. Hierzu wurden ca. 30 Substanzen, darunterunter anderem auch chemisch (hydrolytisch) oder enzymatisch (Penicillinase) gespaltene Antibiotika sowie durch chemische Derivatisierung von Ceftiofur hergestellte Metaboliten (Desfuroylceftiofur = DFC, Desfuroylceftiofur-Acetamid = DFA) getestet. Die EIAs zum Nachweis von Cefalexin zeigten in Abhängigkeit vom verwendeten Antiserum (Kaninchen 3 bzw. Kaninchen 4) neben der Reaktion mit Cefalexin eine relative Kreuzreaktion mit den in der Veterinärmedizin nicht zugelassenen Cephalosporinen Cefaclor (31 % bzw. 53 %), Cefadroxil (55 % bzw. 22 %) und Cephradin (82 % bzw. 73 %). Das Testsystem erwies sich somit unter praktischen Gesichtspunkten als spezifisch für den Nachweis von Cefalexin in Milch. Die EIAs zum Nachweis von Ceftiofur zeigten in Abhängigkeit vom verwendeten Antiserum (Kaninchen 5 bzw. Kaninchen 6) unterschiedliche Kreuzreaktivität. Bei Verwendung des Antiserums von Kaninchen 5 erwies sich das Testsystem als hochspezifisch für Ceftiofur. Bei Verwendung des Antiserums von Kaninchen 6 zeigten sich neben der Reaktion mit Ceftiofur relative Kreuzreaktionen mit den in der Veterinärmedizin nicht zugelassenen Cephalosporinen Cefotaxim (10 %), Cefuroxim (20 %) und Ceftriaxon (29 %), sowie mit Ceftiofur-Metaboliten (5 %). Hier wurde eine mittlere Nachweisgrenze für den Ceftiofur-Hauptmetaboliten DFC von 100 ±± 50 müg/kg ermittelt. Die Kombination beider Testsysteme für Ceftiofur ermöglicht somit eine Differenzierung des Rückstandsgehaltes an Ceftiofur-Muttersubstanz und Metaboliten in Milch. Die praktische Anwendbarkeit der entwickelten EIAs wurde an künstlich kontaminierter, wärmebehandelter Vollmilch und an Rohmilch geprüft. Milchproben wurden durch Zentrifugieren entfettet und ohne weitere Aufbereitung in den kompetitiven direkten EIA zum Nachweis von Cefalexin bzw. den kompetitiven indirekten EIA zum Nachweis von Ceftiofur eingesetzt (Dotierung jeweils 10 -bis 200 ng/ml). Die Wiederfindungsraten für Cefalexin lagen in wärmebehandelter Vollmilch bei 100,1 % bis 128,6 % und in Rohmilch bei 105,3 % bis 132,0 %. Die Wiederfindungsraten für Ceftiofur lagen in wärmebehandelter Vollmilch bei 88,0 % bis 109,4 % und in Rohmilch bei 103,4 % bis 138,7 %. Die praktische Anwendbarkeit der entwickelten EIAs zum Nachweis von Ceftiofur wurde zusätzlich bei Anlieferungsmilchproben im Rahmen der Güteprüfung durch den HVL und in einem Anwendungsversuch zum Ausscheidungsverhalten von Ceftiofur und Ceftiofur-Metaboliten nach therapeutischer Applikation eines cCeftiofurhaltigen Präparates bei laktierenden Rindern überprüft. Die hier vorgestellten EIAs erwiesen sich als gut geeignet zum Rückstandsnachweis dieser beiden Verbindungen entsprechend Verordnung (EWG) Nr. 2377/90. Die Nachweisbarkeit beider Verbindungen lag jeweils deutlich unterhalb der Höchstmenge (MRL: 100 µg/kg).Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2008