In vivo siRNA-Transfektion der Lunge und des Bronchialkarzinoms zur Analyse der Hypoxie-induzierbaren Faktoren in der Tumorprogression
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Zusammenfassung
Die Arbeit befasste sich mit der Etablierung der in vivo siRNA-Transfektion der Lunge und von zwei Lungentumormodellen in der Maus. Ein Lungentumormodell wurde durch die intratracheale Instillation von Lewis-Lung-Karzinomzellen der Maus etabliert (LLC-Modell). Als weiteres Lungentumormodell wurde das subkutane Xenograftmodell durch die subkutane Injektion von humanen Adenokarzinomzellen verwendet (A549-Modell). Bei diesem Modell konnte die Tumorprogression durch direkte Messung des Tumorvolumens einfach verfolgt werden. Es diente insbesondere dazu, durch die Inhibition der Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF-1alpha und HIF-2alpha) deren Rolle für die Tumorprogression zu analysieren. Nach intratrachealer Verabreichung fluoreszenzmarkierter siRNA mit Lipofectamine 2000 an der gesunden Maus war das Lungengewebe nicht transfiziert. Nur luftgefüllte Bereiche der Alveolen und einige Makrophagen (identifiziert durch Durchflusszytometrie) zeigten positive Signale der fluoreszenzmarkierten siRNA. Im LLC-Modell waren nur einige Makrophagen nach intratrachealer siRNA Verabreichung positiv, während das Tumorgewebe negativ war. Bei Verwendung eines weiteren Transfektionsreagenz (in vivo jetPEI ) überlebten die Tiere nach intratrachealer Applikation nicht. Somit erwies sich die intratracheale Verabreichung der siRNA mit den genannten Transfektionsagentien als ungeeignet für die Lunge und das LLC-Modell. Nach intravenöser Verabreichung fluoreszenzmarkierter siRNA über einen Rechtsherzkatheter war die Lunge mit Lipofectamine 2000 und in vivo jetPEI zu transfizieren. Insbesondere zeigten sich positive Signale in der Gefäß- und Bronchuswand und in Zellen der Alveolarsepten. Auch im LLC-Modell zeigten sich bei dieser Form der Verabreichung positive Signale der fluoreszenzmarkierten siRNA. Vor allem gefäßnahe Tumorbereiche und kleine Tumoren zeigten starke Signale. Eine fünffache Dosiserhöhung der siRNA komplexiert mit in vivo jetPEI ergab keine weitere Steigerung der Transfektionseffizienz. Die intravenöse Verabreichung der siRNA über einen Rechtsherzkatheter erwies sich somit als geeignet zur Transfektion der Lunge und des Tumorgewebes im LLC-Modell. Die intraperitoneale Verabreichung von siRNA mit in vivo jetPEI im A549-Modell zeigte starke Signale der fluoreszenzmarkierten siRNA im Tumorgewebe, während andere untersuchte Organe bei dieser Verabreichungsform nicht transfiziert waren. Dieses Verfahren wurde eingesetzt, um HIF-1alpha und HIF-2alpha zu inhibieren. HIF-1alpha und HIF-2alpha konnte im Tumor durch geeignete siRNA (si-HIF-1alpha und si-HIF-2alpha) inhibiert werden. Die Suppression von HIF-1alpha und HIF-2alpha wurde auf mRNA-Ebene durch Real Time RT-PCR von RNA aus Tumorextrakten nachgewiesen. Es zeigte sich jeweils eine signifikante Reduktion der HIF-1alpha oder HIF-2alpha mRNA im Vergleich zu den mit siRNA-ran-(Kontrolle) behandelten Tumoren. Der Effekt von siRNA-HIF-1alpha und siRNA-HIF-2alpha auf die Tumorprogression wurde außerdem über einen Zeitraum von fünf Wochen im Vergleich zu siRNA-ran-behandelten Tieren untersucht, hierbei wurden die siRNAs zweimal wöchentlich verabreicht. Die siRNA-HIF-2alpha-behandelten Tumoren zeigten ein signifikant reduziertes Wachstum im Vergleich zur Kontrolle, während siRNA-HIF-1alpha keine signifikante Änderung des Tumorwachstums aufwies. Die Tumoren wurden histologisch weitergehend charakterisiert. Bei den siRNA-HIF-2alpha-behandelten Tumoren zeigte sich eine signifikante Reduktion der Angiogenese gemessen durch die Anzahl der Mikrogefäße, sowie eine signifikante Hemmung der zellulären Proliferationsrate, während die Apoptoserate im Vergleich zur Kontrolle signifikant gesteigert war. Bei den siRNA-HIF-1alpha-behandelten Tumoren zeigte sich keine signifikante Änderung der Angiogenese und Apoptoserate, während die zelluläre Proliferationsrate signifikant reduziert war. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Transfektion synthetischer siRNA in vivo möglich ist, und insbesondere die Lunge über den Rechtsherzkatheter für siRNA erreichbar ist. Des Weiteren zeigte diese Arbeit, dass die siRNA-Technik, in vivo eingesetzt, Untersuchungen zur Genfunktion bei der Tumorprogression zulässt. Insbesondere wurde gezeigt, dass HIF-2alpha eine entscheidende Rolle in der Progression und Angiogenese von Adenokarzinomen der Lunge spielt und somit ein viel versprechendes Ziel für therapeutische Ansätze bietet.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2007