Functional characterization of an effector candidate of the root colonizing fungus Piriformospora indica during interaction with plants

Abstract

Plants have evolved a sophisticated two-layered immune system to protect themselves from microbial invaders. However, in order to promote infection, plant associated microbes including pathogens as well as mutualists secrete molecules called effectors to suppress the plant s immune response. Mutualistic fungi including the arbuscular mycorrhiza (AM) Glomus intraradices and the ectomycorrhiza (ECM) Laccaria bicolor secretes effector proteins which contribute to the establishment and maintenance of mutualistic symbiosis by suppressing host immunity during root colonization.The root endophytic fungus, Piriformospora indica is capable of colonizing the roots of a wide variety of different plant species including the monocot barley (Hordeum vulgare) and the dicot Arabidopsis thaliana and establishes mutualistic symbiosis during colonization. The colonization pattern of P. indica is mainly divided into two phases, an initial biotrophic phase and a later cell death-associated colonization phase. Colonization by the fungi which is mostly limited to the root cortex cells leads to several beneficial effects to the host such as growth promotion, increased resistance to biotic and abiotic stresses. The recently released genome of P. indica helped to identify hundreds of small secreted proteins (SSPs) coding for candidate effectors and provides an opportunity to investigate the role of these effectors during the interaction between this endophytic fungus with plants. It has been reported that P. indica actively suppresses PTI to colonize and establish a mutualistic relationship with plants. However, the deployment of effectors and their role during the interaction of P. indica with plants has not been reported.In this study, PIIN_08944, an effector candidate of P. indica was functionally characterized in- planta. PIIN_08944 encode a 120 amino acid protein with a predicted 23 amino acid N-terminal signal peptide. Expression profile analysis revealed that PIIN_08944 was induced in in-vitro germinated P. indica chlamydospore as well as in-planta during colonization of Arabidopsis roots by P. indica. To investigate the functional role of PIIN_08944 in mutualistic symbiosis, transgenic P. indica with reduced production or complete loss of PIIN_08944 were generated. RNAi silencing as well as deletion of the gene coding for PIIN_08944 by homologous recombination resulted in delayed colonization of Arabidopsis roots by P. indica. On the hand transgenic Arabidopsis and barley plants expressing PIIN_08944 show enhanced colonization by P. indica compared to wild type. Heterologous expression of PIIN_08944 in barley suppresses flg22 and chitin triggered ROS production. Meanwhile expression of PIIN_08944 in Arabidopsis interfered with the transcription of marker genes for PTI, AtWRKY22 and salicylic acid, CBP60g. However, the expression of PIIN_08944 in Arabidopsis and barley did not affect the plant s response to the necrotrophic fungal pathogens Botrytis cinerea and Fusarium graminearum respectively. Yeast two hybrid screen revealed that PIIN_08944 interacts with CSN5A and CSN5B, components COP9 signalosome protein complex, in Arabidopsis and N. benthamiana and with SINA3, a member of the SEVEN IN ABSENTIA family of E3 protein ligase in tobacco. Subcellular localization assays performed on N. benthamiana leaves revealed that CSN5A, CSN5B and PIIN_08944 localized to the nucleus and cytoplasm. In summary, the fact that PIIN_08944 targets the evolutionarily conserved eukaryotic proteins, CSN5A and CSN5B and interfere with basal defense, indicate that P. indica has evolved strategies involving the use of effectors as general compatibility determinants to establish and/or maintain a mutualistic relationship during interaction with plants. Moreover, this might further explain the capability of P. indica to colonize a multitude of different plant species. Pflanzen haben im Laufe der Evolution ein zweischichtiges Immunsystem entwickelt, um sich von mikrobiellen Eindringlingen zu schützen. Auf der anderen Seite können Mikroben einschließlich Krankheitserreger sowie Mutualisten so genannte Effektor-Moleküle sekretieren, um eine Infektion zu fördern und eine Immunantwort der Pflanze zu unterdrücken. Mutualistische Pilze, einschließlich der arbuskulären Mykorrhiza (AM) Glomus intraradices und der Ektomykorrhiza (ECM) Laccaria bicolor, sekretieren Effektor-Proteine, um Wirtsimmunität bei Wurzelbesiedlung zu underdrücken und somit dienen diese Effektoren zur Etablierung und dem Erhalt der mutualistischen Symbiose.Der Wurzel endophytische Pilz Piriformospora indica ist fähig Wurzeln einer Vielzahl von verschiedenen Pflanzenarten, einschließlich der monokotylen Gerste (Hordeum vulgare) und dem zweikeimblättrigen Arabidopsis thaliana, zu kolonisieren und etabliert eine mutualistischen Symbiose. Die Besiedlung Strategie von P. indica wird hauptsächlich in zwei kolonisierungs Phasen unterteilt. Einer ersten biotrophen und einer späteren Zelltod-assoziierten Phase. Die Kolonisierung durch den Pilz, die meist auf die Wurzel Cortex Zellen begrenzt ist, führt zu mehreren positiven Effekten auf den Wirt, wie Wachstumsförderung und erhöhte Resistenz gegen biotische und abiotische Stressfaktoren. Das kürzlich veröffentlichte Genom von P. indica zeigte hunderte von kleinen sekretierten Proteine (SSP), welche Effektor Kandidaten kodieren. Dies bietet die Möglichkeit, die Rolle dieser Effektoren bei der Interaktion zwischen endophytischen Pilz und Wirtspflanze zu untersuchen. Es wurde bereits berichtet, dass P. indica aktiv PTI unterdrückt um den Wirt zu kolonisieren. Allerdings ist der genaue Einsatz der Effektoren und deren Rolle bei der Wechselwirkung zwischen P. indica und den Wirtspflanzen noch nicht bekannt.In dieser Studie wurde der Effektor Kandidat von P. indica PIIN_08944 funktionell in- planta charakterisiert. PIIN_08944 kodiert ein 120 Aminosäuren langes Protein mit einem prognostizierten 23 Aminosäuren N-terminales Signalpeptid. Expressionsanalysen ergaben, dass in vitro PIIN_08944 in gekeimten P. indica Chlamydospore sowie in planta während der Kolonisation von Arabidopsis Wurzeln, erhöht induziert ist. Um die Funktinalität des PIIN_08944 in der mutualistischen Symbiose zu untersuchen, wurde transgener P. indica mit reduzierten Produktions oder vollständigen Verlust des PIIN_08944 hergestellt. RNAi-Silencing sowie Deletion von PIIN_08944 gene durch homologe Rekombination führte zu einer verzögerten Besiedlung von P. indica an Arabidopsis Wurzeln. Auf der anderen Seite zeigen transgene Arabidopsis und Gerste Pflanzen, die PIIN_08944 exprimieren, verbesserte Besiedlung mit P. indica im Vergleich zum Wildtyp. Die heterologe Expression von PIIN_08944 in Gerste unterdrückt flg22- und Chitin- ausgelöste ROS-Produktion. Wohingegen Expression von PIIN_08944 in Arabidopsis suppremiert die Transkription von Markergenen für PTI, AtWRKY22 und Salicylsäure, CBP60g. Die Expression von PIIN_08944 in Arabidopsis und Gerste hatte jedoch keinen Einfluss auf die Verteidigungsantwort der Pflanze gegen die nekrotrophen Pilzerreger Botrytis cinerea und Fusarium graminearum. Yeast two hybrid Screening ergab, dass PIIN_08944 mit CSN5A und CSN5B Komponent COP9 Signalosom Proteinkomplex, in Arabidopsis und N. tabaccum und mit SINA3, ein Mitglied der SEVEN IN ABSENTIA Familie E3-Protein-Ligase, in Tabak interagiert. Subzelluläre Lokalisierungs assays an N. benthamiana Blättern zeigten eine Lokalisation von CSN5A, CSN5B und PIIN_08944 im Zellkern und im Cytoplasma. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass PIIN_08944 als Effektor auf die evolutionär konservierte eukaryotischen Proteinen, CSN5A und CSN5B abzielt und somit die basale Abwehr der Wirtspflanze stört. Dadurch wird gezeigt, dass P. indica Effektoren als allgemeine Kompatibilitäts Determinanten zur Etablierung und / oder zum Erhalt einer mutualistischen Beziehung innerhalb der Interaktion mit Pflanzen gebraucht. Außerdem könnte dies erläutern, wie es P. indica befähigt eine Vielzahl von verschiedenen Pflanzenarten zu besiedeln.