Untersuchungen zu Assoziationen von Mikrosatelliten und Kandidatengenen mit der Scrapieempfänglichkeit beim Schaf
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Zusammenfassung
Das Ziel der Arbeit bestand darin, Mikrosatelliten auf Schafchromosomen 14 und 15 sowie funktionelle und positionelle Kandidatengene beim Schaf auf eine Assoziation mit der Empfänglichkeit für klassische und atypische Scrapie hin zu überprüfen.Hierzu wurden 102 klassisch scrapiepositive Tiere und 71 atypisch scrapiepositive Tiere, die in den Jahren 2002 - 2005 in Deutschland als scrapiepositiv identifiziert worden waren, untersucht. Als Kontrolle dienten 441 scrapienegative oder unverdächtige Herdenmitglieder.Die Mikrosatelliten MCM 159, MCMA53, UWCA5, CSAP26E, CSRD63, BM6507, MCMA16, BMS2812 und RM004 wurden in drei Multiplex-PCRs amplifiziert und anschließend elektrophoretisch aufgetrennt. Die Allelfrequenzen wurden für scrapiepositive und Kontrolltiere nach Scrapietyp getrennt ermittelt und untereinander verglichen. Hierbei ergaben die Mikrosatelliten MCMA53 und MCMA16 hoch signifikante bzw. signifikante Unterschiede in den Allelfrequenzen zwischen atypisch scrapiepositiven Tieren und Kontrolltieren. In den von klassischer Scrapie betroffenen Herden unterschieden sich die Allelfrequenzen des Mikrosatelliten MCM159 deutlich zwischen positiven und Kontrolltieren. Diese Ergebnisse können auf Gene in der Nähe der genannten Mikrosatelliten hindeuten, die die Scrapieempfänglichkeit beim Schaf beeinflussen.Im ovinen Cathepsin B konnte in der Sequenzanalyse eine Nukleotidsubstitution (C>T) an Position 391 des neunten Introns nachgewiesen werden. Durch PCR-RFLP-Analyse mit dem Enzym LweI konnten die Allele identifiziert werden. Zwischen scrapiepositiven Tieren und Kontrolltieren wurden weder in den Genotypfrequenzen noch in den Allelfrequenzen signifikante Unterschiede festgestellt.An Position 12 des neunten Exons des ovinen Cathepsin D wurde eine stille Mutation (C>T) detektiert. Bei Vorliegen des Wildtypallels (C) wurde an dieser Stelle durch das Programm ESEfinder 3.0 ein potentieller Exon Splicing Enhancer (ESE) identifiziert. Dieser konnte bei dem mutierten Allel (T) nicht mehr detektiert werden. Die scrapiepositiven Tiere und Kontrolltiere wurden an Position 12 des neunten Exons mit Hilfe eines PCR-RFLP durch das Enzym BseYI typisiert. Es konnten jedoch weder bei den atypisch noch bei den klassisch scrapiepositiven Tieren im Vergleich zu den Kontrolltieren signifikante Unterschiede in den Genotyp- oder Allelfrequenzen festgestellt werden.Beim ovinen Calpain, Large Polypeptide L2 wurde der Promotorbereich und ein Teil des ersten Exons untersucht. Über die gesamte Länge der Sequenz wurde eine CpG-Insel mit zwei G/C-Boxen identifiziert. Die in der Sequenz vorliegenden Motive lassen auf eine fehlende Methylierung schließen und sprechen für eine Zugehörigkeit des Calpain, Large Polypeptide L2 zu der Familie der Housekeeping Gene. An der 191. Position vor Beginn des ersten Exons wurde im Promotorbereich eine Nukleotidsubstitution (G>T) detektiert. Bei Vorliegen des Wildtypallels (G) wurde durch das Programm MatInspector eine potentielle Bindungsstelle für den Transkriptionsrepressor Zinc Finger Protein Insulinoma-associated 1 (IA-1) festgestellt, welche bei dem mutierten Allel (T) nicht vorlag. Scrapiepositive Tiere und Kontrolltiere wurden durch eine ASPCR typisiert und zweifelhafte Ergebnisse wurden mit Hilfe einer nested PCR mit sich anschließendem RFLP durch das Enzym MvaI abgesichert. Zwischen positiven und Kontrolltieren konnten bei keinem Scrapietyp signifikante Unterschiede in Genotyp- oder Allelfrequenzen festgestellt werden.Im Kallikrein 1-Gen wurde an Position 392 des vierten Introns eine Nukleotidsubstitution (C>T) detektiert. Zum Nachweis der Mutation wurde ein PCR-RFLP mit dem Enzym BsmFI durchgeführt. Weder bei den klassisch scrapiepositiven Tieren noch bei den atypisch scrapiepositiven Tieren konnte in Genotyp- oder Allelfrequenzen ein signifikanter Unterschied zu den Kontrolltieren festgestellt werden. An der 206. Position vor Beginn des siebten Exons wurde im sechsten Intron des ovinen Transforming Growth Factor, beta1 in der Sequenzanalyse eine Nukleotidsubstitution (G>T) detektiert. Atypisch und klassisch scrapiepositive Tiere sowie Kontrolltiere wurden mit Hilfe eines PCR-ACRS mit dem Enzym BseGI typisiert. Es konnten keine signifikanten Unterschiede in den Genotyp- oder Allelfrequenzen zwischen positiven Tieren und Kontrolltieren festgestellt werden. Für zukünftige Studien würde die Untersuchung funktioneller Kandidatengene in der Nähe der Mikrosatelliten MCMA53, MCMA16 und MCM159 eine mögliche Vorgehensweise darstellen. In der vorliegenden Arbeit konnten keine Hinweise darauf gefunden werden, dass die hier untersuchten Gene einen Einfluss auf die Scrapieresistenz beim Schaf ausüben, weswegen sie für weitere Untersuchungen nicht von großem Interesse sind. Zukünftig ist es anzustreben, genomweit mit Hilfe eines Genchips und mit vergrößertem Probenmaterial auf für die Scrapieresistenz bedeutende Gene zu suchen.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Göttingen : Sierke