Endotheliale Wirkmechanismen von rekombinantem aktiviertem Protein C : Am Beispiel von Fractalkine,Transforming Growth Factor-beta 2 und Cyclooxygenase-2
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Zusammenfassung
Aktiviertes Protein C hat neben seinen antikoagulativen, profibrinolytischen, antiinflammatorischen und antiapoptotischen Eigenschaften noch zusätzlich Wirkungen, die insbesondere im Rahmen der Sepsistherapie von wichtiger Bedeutung sein können. APC nimmt damit einen wichtigen Platz im Wechselspiel zwischen Entzündung und Gerinnung ein. Studien an Patienten mit schwerer Sepsis haben gezeigt, dass die Behandlung mit rhAPC die Mortalität senkt. Diese günstige Wirkung von APC kommt unter anderem durch eine Modulation der Genexpression von verschiedenen Mediatoren in einer Vielzahl von Zellsystemen zustande. Die direkte antiinflammatorische Wirkung des APC wurde jedoch bisher nur in vitro gefunden. Eine eindeutige antiinflammatorische Wirkung des APC in vivo ist bis zu diesem Zeitpunkt nicht messbar gewesen. Umso mehr ist es von Interesse, die einzelnen Wirkmechanismen, über die APC seine protektive Wirkung in der Sepsis entfaltet, näher zu charakterisieren. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst mittels Affymetrix®-Genarray mögliche Angriffsorte von aktiviertem Protein C (APC) auf die endotheliale Genexpression aufgedeckt. Hierbei ergaben sich einige funktionell wichtige Zytokine, Chemokine und Mediatoren des Prostaglandinhaushalts die durch APC in ihrer Expressionsrate moduliert wurden. Hierzu gehörten das Chemokin Fractalkine, der Wachstumsfaktor und Immunmodulator Transforming Growth factor-ß2 und die im Prostanoidstoffwechsel bedeutsame Cyclooxygenase-2 (COX-2). Nach ersten Screening-Experimenten wurden Bestätigungsexperimente auf messenger-RNA-Ebene und Proteinebene durchgeführt, beteiligte Rezeptoren und intrazelluläre Mechanismen näher untersucht, und es wurde in der Diskussion der Arbeit auf die mögliche funktionelle Relevanz der beobachteten Veränderungen eingegangen. Für das Chemokin Fractalkine konnte in Übereinstimmung mit den Resultaten aus dem Affymetrix®-Genarray eine zeit- und konzentrationsabhängige Steigerung der endothelialen mRNA und des Proteins unter dem Einfluß von APC gezeigt werden. Es wurde festgestellt, dass nur das aktivierte Protein C eine Wirkung auf die Fractalkine-Synthese und -Freisetzung ausübt. Der Einsatz des Zymogens Protein C bewirkte keine Veränderungen auf die Fractalkine-Freisetzung. Es konnte ermittelt werden, dass APC seine Wirkung auf die vermehrte Fractalkine-Expression ausübt, indem der Protease-aktivierbare Rezeptor-1 aktiviert wird. Eine Beteiligung des PAR-2 konnte ausgeschlossen werden. Im Weiteren wurde die Wirkung von APC auf den Wachstumsfaktor und Immunmodulator TGF-ß2 mit Hilfe von rtPCR und Immunoassay genauer betrachtet. APC bewirkte eine Steigerung der mRNA und auch der Proteinfreisetzung von TGF-ß2 aus humanen Endothelzellen. In folgenden in vitro-Versuchen an humanen Endothelzellen (HUVEC) wurden Mediatoren des Prostaglandinhaushalts untersucht: RhAPC bewirkte eine Steigerung der endothelialen Expression von COX-2-mRNA und COX-2-Protein. Der erhöhte endotheliale COX-2-Proteingehalt bedingte eine verstärkte Freisetzung des Syntheseprodukts Prostazyclin. Die Expression der konstitutiven COX-1 und der Prostaglandin-I2-Synthase (PGIS) wurde durch APC nicht beeinflusst. Das nicht aktivierte Protein C hatte keinen Effekt auf die COX-2-Expression. Durch blockierende Antikörper gegen den PAR-1 (Protease-aktivierbarer Rezeptor-1) konnte ermittelt werden, dass APC sehr wahrscheinlich die COX-2-Expression in HUVEC durch Signaltransduktion über den PAR-1-Rezeptor moduliert. Wie bereits zuvor gezeigt, liegt die funktionelle Bedeutung einer gesteigerten COX-2-Expression und Prostazyclin-Synthese in der Verbesserung der Mirkrozirkulation, der Reduktion der Kapillarpermeabilität, einer zytoprotektiven und plättchenaggregations-hemmenden Wirkung sowie der Reduktion der Zytokinfreisetzung aus aktivierten Monozyten. Die klinische Bedeutung der hier beschriebenen und diskutierten Wirkmechanismen von APC sollte kritisch betrachtet werden, da meist supratherapeutische Dosierungen von rhAPC eingesetzt wurden. Dennoch sind derartige Zellkulturuntersuchungen wichtig, um orientierende Hinweise auf die molekularen Wirkmechanismen einer pharmakologisch wirksamen Substanz zu bekommen. Weitere in vivo Untersuchungen müssen klären, ob die hier vorgeschlagenen Mechanismen auch in vivo von Bedeutung sind und für die günstigen Wirkungen von rhAPC auf das Überleben von Patienten mit schwerer Sepsis verantwortlich gemacht werden können.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2007