Lasergestützte Zellcharakterisierungen in der präklinischen Forschung : Gerätevalidierung und Erstellung von Referenzintervallen für die Tierarten Hund und Ratte

Abstract

Ziel dieser Arbeit ist es, verschiedene Untersuchungsmethoden für die Tierarten Ratte und Hund in der präklinischen Forschung zu etablieren. Im Mittelpunkt stehen Untersuchungen an den hämatologischen Analysesystem Sysmex XT-2000iV und Siemens ADVIA® 120 für den speziellen Einsatz im GLP-kompatiblen Laborumfeld. Ein weiterer Schwerpunkt liegt in der vergleichenden Untersuchung hämatologischer Parameter zwischen verschiedenen Tiergruppen und in der Erstellung von Referenz-intervallen. Die Untersuchungen erfolgen mit Blutproben von Wistar Ratten und Marshall Beagle aus präklinischen Sicherheitsstudien. Die Präzision für den XT-2000iV (Messmodi Manual und Capillary ) und den ADVIA® 120 wird mit zwei gepoolten Blutproben der Ratte mit unterschiedlicher Zusammensetzung geprüft eine hat höhere Werte für die Leukozytenpopulationen als die andere. Der XT-2000iV und der ADVIA® 120 weisen für die Blutzellzählung gute bis exzellente Variationskoeffizienten auf (CV zwischen 0,22% und 7,66%). Für die Blutzelldifferenzierung zeigt die Probe mit hohen Anteilen von Leukozytenpopulationen im Blut ebenfalls überwiegend gute Werte am ADVIA® 120 und im Modus Manual des XT-2000iV (CV zwischen 0,72% und 11,54%). Für die Messung der Monozyten am ADVIA® 120 fällt das Ergebnis schlechter aus (CV = 26,65% und 28,00%). Sinkt die Konzentration von einzelnen Zellpopulationen im Blut, wird das Ergebnis der Präzision tendenziell schlechter. Im Verdünnungsmodus des XT-2000iV werden ebenfalls höhere Werte für den Variationskoeffizienten gefunden. Der Methodenvergleich des XT-2000iV mit dem ADVIA® 120 für die Tierart Ratte ergibt für die Parameter WBC, RBC, MCH, MCV und PLT gute bis exzellente Korrelationen (Spearman s rank rs = 0,89 bis 0,99). Für HGB und HCT ist die Korrelation mäßig (rs = 0,77 und 0,75) und für MCHC (rs = 0,25) schlecht. Für die Parameter Neutrophile (%), Lymphozyten (%, #) und Eosinophile (#) ist die Übereinstimmung gut bis exzellent (rs = 0,84 bis 0,99). Mäßige Ergebnisse zeigen Neutrophile (#), Monozyten (#) und Eosinophile (%) (rs = 0,64 bis 0,79). Für Basophile (%, #) und Monozyten (%) ist die Korrelation schlecht (rs = 0,23 bis 0,41). Die gemessenen Monozytenwerte des XT-2000iV liegen über denen des ADVIA® 120. Für die Retikulozyten liegen die Korrelationskoeffizienten bei rs = 0,83 (#) bzw. rs = 0,92 (%). Im Vergleich zur Leukozytendifferenzierung am Mikroskop schneiden beide Geräte ähnlich ab. Für die neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten fällt das Ergebnis zufriedenstellend aus, während für die Monozyten und Eosinophilen schlechte Werte erzielt werden. Wistar Ratten von zwei verschiedenen Züchtern zeigen im Vergleich signifikante Unterschiede in zahlreichen hämatologischen Parametern. Für sowohl männliche als auch weibliche Tiere unterscheiden sich die Parameter WBC, RBC, MCV, MCH, PLT, MPV, PCT, Lymphozyten, Monozyten, Eosinophile und Retikulozyten signifikant. Für die weiblichen Tiere unterscheiden sich zusätzlich die Parameter HGB und HCT.Für die Ratte (Stamm Wistar, Züchter 1) werden geschlechtsspezifische 95%-Referenzintervalle für das hämatologische Analysegerät Sysmex XT-2000iV erstellt. Auch für die Tierart Hund (Marshall Beagle, männlich und weiblich) werden 95%-Referenzintervalle errechnet für den XT-2000iV und für durchflusszytometrisch gemessene CD-Marker (CD3+CD4+ - T-Helferzellen; CD5+ - T-Zellen; CD5+CD8+ - zytotoxische T-Zellen; CD21+ - B-Zellen, CD9-positive Zellen und CD4/CD8-Verhältnis). Die Hunde zeigen eine Zweiteilung der CD5 und CD8 doppelt-positiven Zellpopulation, die quantitativ ausgewertet werden kann. Dies ergibt für die meisten Hunde einen höheren Anteil von Zellen, die stärker Antigen exprimieren. Schließlich werden die retikulierten Thrombozyten des Hundes am Durchflusszytometer FACSCanto und am XT-2000iV gemessen. Für beide Messsysteme werden Referenzintervalle erstellt. Die Korrelation zwischen beiden Messmethoden fällt schlecht aus (r = 0,42), vermutlich aufgrund des eingeschränkten Messbereiches. Für die Präzision zeigt das Durchflusszytometer bessere Werte als der XT-2000iV (XT: CV = 16,08% ( Manual ), 15,32% ( Capillary ); FACS: CV = 7,48%). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Sysmex XT-2000iV für den Einsatz im präklinischen Forschungslabor für die Tierart Ratte geeignet ist. Für eine abschließende Bewertung sollten in einer weiteren Studie die Linearität, der Carry-over und der Einfluss der Lagerungstemperatur und der Lagerungsdauer auf die Messung überprüft werden. Die Untersuchung der beiden Rattengruppen zeigt deutliche herkunftsbedingte Unterschiede für hämatologische Parameter. Dies unterstützt die Notwendigkeit von Kontrollgruppen in Studien um eine Fehlinterpretation der erhobenen Daten zu vermeiden. Weiterhin ist die Auswahl der geeigneten Gruppe je nach Fragestellung der Studie anzuraten. Die erstellten Referenzintervalle für Hunde und Ratten können eine Grundlage für die Beurteilung von Daten aus präklinischen Sicherheitsstudien bilden.Die Verwendung des XT-2000iV zur Messung von retikulierten Thrombozyten des Hundes ist sinnvoll. Jedoch sollte mittels einer weiteren Studie, die Proben von thrombozytopenischen Tieren einschließt, eine abschließende Beurteilung vorgenommen werden. aim of this study is to establish several methods for analyzing blood of rats and dogs in preclinical research. The focus is on the hematology analyzer Sysmex XT-2000iV and ADVIA® 120 for use in GLP-compatible laboratories. A second main topic is the comparative analysis of hematologic variables between different animal groups and the calculation of reference intervals. Wistar rats and Marshall Beagle used in preclinical safety studies are included in the study.Intra-assay precision is determined for the XT-2000iV (mode manual and capillary ) and the ADVIA® 120 with two different pooled blood samples of rats one of them with higher values for leucocyte subpopulations than the other. XT-2000iV and ADVIA® 120 reflect well to excellent coefficients of variation for variables of blood cell count (CV between 0.22% and 7.66%). Results for blood cell differentiation are good for the sample with high quantities of leucocytes measured with XT-mode manual and ADVIA® 120 (CV between 0.72% and 11.54%). Measurement of monocytes with the ADVIA® 120 indicates poorer results (CV = 26.65% and 28.00%). Decreasing leucocyte values in blood samples result in increasing coefficient of variations. Moreover, coefficients of variation are higher for the XT-mode capillary in comparison to manual . Agreement between XT-2000iV and ADVIA® 120 are good to excellent for WBC, RBC, MCH, and platelets with Spearman rank correlation coefficients (rs) ranging from 0.89 to 0.99. A fair correlation is evident for HGB and HCT (rs = 0.77 and 0.75), whereas correlation for MCHC is poor (rs = 0.25). A good to excellent correlation is recognized for neutrophils (%), lymphocytes (%, #) and eosinophils (#), rs ranging from 0.84 to 0.99. Neutrophils (#), monocytes (#) and eosinophils (%) show fair results (rs = 0.64 to 0.79). However, correlation between both analyzers is poor for basophils (%, #) and monocytes (%) (rs = 0.23 and 0.41). Values for monocytes measured by the XT-2000iV are higher compared to them obtained by the ADVIA® 120. Correlation coefficient for reticulocytes are rs = 0.83 (#) and rs = 0.92 (%). Comparisons of manual leucocyte differentiation with both analyzers are similar. While the results obtained for neutrophilic granulocytes and lymphocytes are adequate, they are poor for monocytes and eosinophils. Wistar rats obtained from two different breeders show significant differences for many hematologic variables. WBC, RBC, MCV, MCH, platelets, MPV, PCT, lymphocytes, monocytes eosinophils and reticulocytes show differences for male and female animals. Additionally, HGB and HCT are different in females. Reference intervals are calculated for male and female rats (strain Wistar, breeder 1) for the hematologic analyzer Sysmex XT-2000iV. 95%-Reference intervals are also calculated for dogs (Marshall Beagle, male and female) for the XT-2000iV and for CD-marker measured flowcytometrically (CD3+CD4+ - T-helpercells; CD5+ - T-cells; CD5+CD8+ - cytotoxic T-cells; CD21+ - B-cells, CD9-positive cells and CD4/CD8 ratio). Dogs have two different types of CD5+CD8+ double positive lymphocytes with varying degree of antigen expression. Quantification show a majority of cells with high expression (high fluorescence) for most animals.Finally, reticulated platelets for dogs are measured with FACSCanto flow cytometer and XT-2000iV. Reference intervals are calculated for both methods. Correlation between both analyzers is poor (rs = 0.42), probably due to limited range of values. Intra-assay precision is better for FACSCanto flow cytometer (CV = 7.48%) compared to the XT-2000iV (CV = 16.08% (mode manual ), CV = 15.32% (mode capillary ).In conclusion, Sysmex XT-2000iV is a good hematologic system for use in preclinical research with blood samples from rats. Additional studies evaluating linearity, carry-over and influence of temperature and storage duration are necessary for a final assessment. Rats of two different origins show significant differences for hematologic variables. These results indicate the need of control groups in studies for avoiding misinterpretation of acquired data. Additionally, choosing the adequate animal group for different topics of research is recommended. Calculated reference intervals for rats and dogs are good for evaluating data obtained in preclinical safety studies.Using the XT-2000iV is a useful tool for analyzing reticulated platelets in blood samples from dogs. However, for complete evaluation additional studies should be performed including samples from animals with thrombocytopenia.