Gentechnische Herstellung und Charakterisierung der Exotoxine Beta und Beta2 von Clostridium perfringens
Lade...
Datum
Autor:innen
Betreuer/Gutachter
Weitere Beteiligte
Beteiligte Institutionen
Herausgeber
Zeitschriftentitel
ISSN der Zeitschrift
Bandtitel
Verlag
Lizenz
Zitierlink
Zusammenfassung
Zentraler Bestandteil der Bekämpfung C. perfringens-bedingter Durchfallerkrankungen von Ferkeln ist die Muttertierschutzimpfung mit Toxoidvakzinen. Da die zugelassenen Impfstoffe kein Beta2-Toxoid enthalten sind Neuentwicklungen unabdingbar. Eine Schlüsselrolle kommt der Herstellung der Toxine Beta und Beta2 zu, die für Wirksamkeitsnachweise, Pathogenitäts- und Immunisierungsstudien benötigt werden. Auf Grund ihrer besonderen Empfindlichkeit und der vielen Major- und Minortoxine, die C. perfringens-Wildstämme bilden, ist die heterologe, rekombinante Expression und affinitätschromatographische Aufreinigung zweckmäßig.Das Beta2-Toxin konnte mit dem pASK-IBA-Vektorsystem in E. coli TOP10F´ exprimiert und in SDS-PAGE, ELISA, Western und Immunblot nachgewiesen werden. Ein C-terminal mit einem Strep-Tag® II versehenes Beta2-Toxin aus dem Periplasma induzierter Klone wurde zur Gewinnung poly- und monoklonaler Antikörper genutzt, die natives Beta2-Toxin im Kulturüberstand von C. perfringens detektierten. Es besaß jedoch keine Aktivität im Mausmodell oder im Zellkulturversuch mit Caco-2- und IPEC-J2-Zellen. Daher wurden weitere Expressionsklone erzeugt. Doch auch durch Variation der Position des Strep-Tag® II Affinitätsanhängsels (C- bzw. N-terminal), des Expressions¬kompartimentes (Zyto- und Periplasma) und des Expressionswirtes (TOP10F´ und Rosetta-gami 2) gelang es in E. coli nicht, ein Beta2-Toxin mit toxischer Wirkung im Zell- oder Tierversuch zu gewinnen. In einem weiteren Ansatz wurde das Beta2-Toxingen einschließlich seines Signalpeptids mittels Plasmidvektor pHT01 auf den phylogenetisch näher mit C. perfringens verwandten Expressionsstamm B. subtilis WB800N übertragen. Die Sequenz des rekombinanten Beta2-Toxins entsprach exakt der des Wildtyp-Toxins aus C. perfringens. Die Expressionsbedingungen waren auf Produktschonung des temperatur- und sauerstoffempfindlichen Produktes ausgerichtet. Dennoch waren Beta2-Toxin-haltige Konzentrate des Kulturüberstandes für Caco-2 und IPEC-J2-Zellen atoxisch.Das Beta-Toxin-Gen cpb wurde mit Vektor pASK-IBA5plus ligiert und das resultierende Plasmid pHIT-VIc-42 auf E. coli TOP10F´ übertragen. Nach Induktion des Expressionsklons konnte das rekombinante Beta-Toxin mit N-terminalem Strep-Tag® II aus Ganzzelllysaten affinitätschromatographisch aufgereinigt und in SDS-PAGE, ELISA und Western Blot dargestellt werden. Nach intraperitonealer Applikation war es toxisch für BALB/c- und NMRI-Mäuse. Für letztere wurde eine halbletale Dosis von 78 µg/kg bzw. 1,56 µg/Tier ermittelt. Die letale Wirkung war damit im Vergleich mit einem aus C. perfringens-Kulturüberständen gewonnenen Toxin reduziert, was vermutlich auf das Affinitätsanhängsel zurückzuführen ist. Drei rekombinante Beta-Toxine anderer Arbeitsgruppen zeigten in Anwesenheit eines Affinitätsanhängsels keine Aktivität.Erstmalig wurde somit ein fusioniertes, biologisch aktives Beta-Toxin erzeugt, das für Neutralisationsversuche im Rahmen der Impfstoffzulassung zur Verfügung steht. Die gewonnenen Beta2-Toxin-Varianten besitzen keine biologische Aktivität obwohl sie sich sequentiell vom nativen Toxin aus C. perfringens nicht bzw. lediglich durch das angefügte Affinitätsanhängsels unterscheiden. Sie können zur Herstellung von Antikörpern und als Impfantigen genutzt werden.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : http://www.dvg.net/ DVG Service, 2010