Vergleichende Darstellung von Dichlorodihydrofluorescein und Dihydrocalcein zur Messung von reaktiven Sauerstoffspezies
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Zusammenfassung
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen in der Physiologie und der Pathophysiologie des vaskulären Systems eine wichtige Rolle. ROS beeinflussen eine Vielzahl zentraler Prozesse innerhalb der Zelle. Eine Störung der Homöostase und der daraus resultierende Anstieg von ROS wird als oxidativer Stress bezeichnet und führt zu pathophysiologischen Veränderungen. Schwierigkeiten in der Untersuchung von ROS ergeben sich vor allem aufgrund mangelnder Quantität der etablierten Meßmethoden in lebenden Zellen. In der vorliegenden Arbeit werden Untersuchungen zur Validierung von H2-Calcein als neue Substanz zur Messung von ROS zusammengefasst und dessen Sensitivität und Spezifität in Rattenglattenmuskelzellen (RSMC) mit dem bereits etablierten H2-DCF verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass H2-Calcein grundsätzlich zur Detektion von ROS geeignet ist und dass es im Vergleich zu DCF eine wesentlich längere intrazelluläre Halbwertzeit vorweisen kann. Obwohl beide Substanzen in vitro ähnliche chemische Eigenschaften besitzen, führt eine auf physiologische Weise gesteigerte intrazelluläre ROS-Produktion in RSMC nicht zu einer gesteigerten Calcein-Fluoreszenz, während bei DCF eine signifikanter Zunahme der Fluoreszenz dargestellt werden kann. Letzteres Ergebnis konnte mittels ESR-Messungen bestätigten werden. Im konfokalen Mikroskop konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen in unterschiedlichen Zellkompartimenten akkumulieren. DCF ist größtenteils im Zytoplasma lokalisiert, während Calcein fast ausschließlich auf die Mitochondrien beschränkt ist. Darüber hinaus konnte in submitochondrialen Partikeln (SMP) gezeigt werden, dass H2-Calcein, nicht aber H2-DCF, die Aktivität des Komplex I hemmt. Aus diesen Beobachtungen kann gefolgert werden, dass die Oxidation von H2-Calcein höchstwahrscheinlich die Konsequenz einer direkten Elektronenübertragung zu dem mitochondrialen Komplex I ist. Folglich ist H2-Calcein zur Messung von intrazellulären ROS ungeeignet und bietet keine Alternative zu H2-DCF.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Free Radical Research, Vol.38 (2004), S. 1257-1267