Modifizierung von DNA-Reparaturproteinen auf Expressionsebene zur Optimierung der therapeutischen Genom Editierung

Abstract

Erbliche Netzhautdefekte werden durch zahlreiche krankheitsauslösende Mutationen verursacht. Das therapeutische Genome Editing zielt darauf ab, diese Mutationen direkt im Genom des Patienten zu therapieren. Das Prinzip beruht hierbei auf programmierbaren Endonukleasen, mit denen man einen künstlichen Doppelstrangbruch erzeugen kann, welcher anschließend durch zelleigene Mechanismen repariert wird.Durch Reparatur des DSB mittels des fehleranfälligen NHEJ-Wegs kommt es zur Ausbildung von Insertionen und Deletionen und somit zur Genveränderung. Beim HDR-Reparaturweg kann ein DNA-Template durch homologe Sequenzen in das Genom eingebracht werden. Je nach Gestaltung des Templates kommt es zur Genkorrektur, -modifikation oder -addition. Der HDR-Reparaturweg ist in den postmitotischen Photorezeptor- und RPE-Zellen jedoch ineffizient.Ziel dieser Arbeit war es, die NHEJ-Aktivität herab zu regulieren, sodass der HDR-Reparaturweg effizienter wird. Hierzu wurde die Expression der im NHEJ-Weg involvierten Nuklease Artemis in murinen Zelllinien durch zwei verschiedene Methoden inhibiert. Artemis ist bei der Endprozessierung der freien DNA-Enden eines DSB beteiligt. Zunächst wurde ein CRISPR/Cas9 vermittelter Knockout des murinen Artemis-Gens in den C2C12 und NIH 3T3 Zelllinien durchgeführt. Zuvor wurden die gRNA/Cas9 Konstrukte erfolgreich auf ihre Schneideeffizienz geprüft. Der zweite Ansatz war ein siRNA-vermittelter Artemis-Knockdown in den murinen NIH 3T3 Zellen.Die NHEJ-Aktivität nach einem Artemis Knockout/Knockdown wurde durch eine BRET-basierte Methodik gemessen. Hierbei ergab sich keine reproduzierbare Herabregulation der NHEJ-Events.Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse weisen auf keinen oder beschränkten Einfluss eines Artemis Knockout/Knockdown auf die NHEJ-Aktivität hin. Dies kann unter anderem darin begründet sein, dass die DNA-Endprozessierung nach einem Artemis Knockout/Knockdown von anderen Nukleasen übernommen wird.In Zukunft sollten die Funktionsweisen der in den Reparaturwegen involvierten Proteine weiterhin genau erforscht werden, um eine bestmögliche Therapiestrategie zu entwickeln.

Inherited retinal dystrophies are caused by multiple disease causing mutations. The therapeutic genome editing aims to correct these mutations within the genome of a patient. The principle of this approach is based on programmable endonucleases by which one can artificially induce double strand breaks which are then repaired by the cell´s own DNA repair mechanisms.The repair of a double strand break via the error-prone NHEJ-pathway leads to the formation of insertions and deletions which is consequently followed by a gene mutation. In case of occurrence of the HDR-pathway a DNA-Template can be integrated into the genome via homologous sequences. Depending on the design of the template one can achieve a gene correction, modification or addition. However, in the postmitotic photoreceptor and RPE cells the HDR-pathway is rather inefficient.The aim of this project was to downregulate the NHEJ-activity in order to increase the efficiency of the HDR-pathway. For this purpose, the expression of the nuclease Artemis which is involved in the NHEJ-pathway was inhibited by two different methods in murine cell lines. Artemis is involved in the end-processing of the free DNA ends of a DSB. Initially, a CRISPR/Cas9 mediated knockout of the murine Artemis gene in the C2C12 and NIH 3T3 cell lines was performed. Previously, the cleavage activity of the gRNA/Cas9 constructs had been successfully examined. The second approach was a siRNA-mediated Artemis knockdown in the murine NIH 3T3 cells.The NHEJ-activity after an Artemis knockout/knockdown was measured by a BRET-based methodology. These experiments showed no reproducible downregulation of the NHEJ-events.The achieved results of this project indicate no or limited impact of an Artemis Knockout/Knockdown on the NHEJ-activity. A possible reason is that the DNA end-processing after an Artemis Knockout/Knockdown is assumed by other nucleases.In future, the functions of the proteins which are involved in the DNA repair mechanisms should be furthermore investigated to develop appropriate therapy strategies.