Charakterisierung molekularer Determinanten zur spezifischen Sekretion von RNAs in extrazelluläre Vesikel

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) werden von fast jeder Zelle des menschlichen Körpers in den extrazellulären Raum sezerniert. Dort können EVs funktionell aktive Biomoleküle zwischen Zellen transportieren und sind somit Bestandteil der Zell-Zellkommunikation. Neben Proteinen, Lipiden und DNA transportieren sie RNAs, darunter verschiedene Klassen von kodierenden und nicht-kodierenden RNAs, von denen einige selektiv in Vesikel verpackt werden. Die Proteinfaktoren, Mechanismen und Sequenzelemente, die diese Spezifität bedingen, sind jedoch noch weitestgehend unbekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, einen Beitrag zum Verständnis über das Beladen von RNAs in EVs zu leisten sowie Charakteristika von EV-RNA zu identifizieren. Dazu wurden Reporterkonstrukte entworfen, die zu verschieden modifizierten Transkripten führten. Zum einen wurden RNAs mit verschiedenen Längen exprimiert und zum anderen RNAs mit verschiedenen Cap-Strukturen sowie mit/ohne Poly(A)-Schwanz. Diese Reporterkonstrukte wurden anschließend in Zellen transfiziert und die exprimierten EV-RNAs quantifiziert. Des Weiteren wurden die in EVs vorhandenen RNA-Mengen absolut quantifiziert. Hierbei wurden sowohl endogene RNAs (U6 snRNA, U1 snRNA, Y1 RNA und GAPDH mRNA) als auch durch Reporterkonstrukte exprimierte RNAs verwendet. Es konnte festgestellt werden, dass kleine RNAs effizienter in EVs verpackt werden als große. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass RNA-Polymerase III-Transkripte im Vergleich zu Polymerase II-Transkripten effizienter in EVs sezerniert werden. Überraschenderweise ergab die quantitative Analyse keine RNA-Akkumulation in den Vesikeln im Vergleich zu dem gesamt- zellulären Level, und dies sowohl bei überexprimierten Reporter-Transkripten als auch bei endogenen RNAs. RNA ist nur in einer niedrigen Kopienzahl (0,02 - 1 Molekül pro EV) mit EVs assoziiert. Da Untersuchungen von vorangegangenen Studien Protein-RNA-Interaktionen zeigten, die das spezifische Beladen von (mi)RNAs in EVs begünstigten, wurde ein in vivo SELEX zur Identifizierung von RNA-Motiven mit anschließender bioinformatischer Auswertung durchgeführt. Hierbei wurden Reporterkonstrukte verwendet, welche einen zufallsgenerierten Pool an RNAs (N40) in den Zellen exprimierten, welche anschließend in EVs verpackt wurden. Durch anschließende EV-RNA-Isolation und Library-Präparation sollten angereicherte Sequenzen identifiziert werden. Es konnte jedoch keine spezifische Anreicherung eines Sequenzmotivs detektiert werden.