Die Bedeutung von mechanischem Stress für die Vaskulogenese embryonaler Stammzellen und die Expression von Axon-Guidance Molekülen

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2013

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-14078

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Bereits in der frühesten Phase der Embryogenese nehmen physikalische Kräfte Einfluss auf die unterschiedlichsten physiologischen Prozesse. Daher sollte in dieser Arbeit die Bedeutung von mechanischen Kräften für die Vaskulogenese eingehender untersucht werden. Dazu wurde hier das EB-Modell verwendet. Dieses in vitro Modell eignet sich auf Grund seiner Eigenschaften (Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktion) besonders für die Untersuchung angiogener Prozesse. Die Daten der vorliegenden Studie zeigen, dass die Applikation von mechanischen Zugkräften zu einem Anstieg der Vaskularisierung der EBs führt. Von besonderer Bedeutung ist dabei der unmittelbar auf die Dehnung folgende Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration. Durch die Zugabe des Chelators BAPTA-AM konnte dieser Anstieg gehemmt und der Effekt der Dehnung auf die Vaskularisierung aufgehoben werden. In den weiteren Untersuchungen konnte zudem ein positiver Einfluss der mechanischen Zugbelastung auf die für die Gefäßbildung förderlichen Faktoren (Axon-Guidance Proteine, Wachstumsfaktoren, ROS, NO, MAPKs und PI3K) nachgewiesen und zum Teil ein Zusammenhang mit dem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration aufgezeigt werden. Die Stressapplikation hatte einen Anstieg der Expression von Proteinen zur Folge, die zur charakteristischen Signatur von Tip- und Stalk-Zellen zählen. So konnte ein Anstieg der Expression von Neuropilin1, PDGF-BB und VEGF-R2 sowie Robo4 und FGF2 gezeigt werden. Die Chelatierung des intrazellulären Kalziums während der Dehnung hatte zur Folge, dass die Zunahme der Expression von Neuropilin1, PDGF-BB und FGF2 ausblieb. Die Bedeutung des VEGF-R2 für die Vaskularisierung in Folge der Zugbelastung konnte zusätzlich durch dessen Inhibierung mit SU5614 dargestellt werden Zudem legt das Expressionsverhalten einiger Proteine einen förderlichen Einfluss der Dehnung auf die Bildung von arteriellem Endothel nahe. So stieg durch die mechanische Zugbelastung die Expression des arteriellen Marker EphrinB2 an, während die des venösen Markers EphB4 signifikant zurückging. Im Zuge der Dehnung der EBs war ein zeitnaher Anstieg der ROS Bildung festzustellen. Die Generierung der ROS konnte durch eine Behandlung der EBs mit dem NADPH-Oxidase spezifischen Inhibitor VAS2870 aufgehoben werden. Dies ermöglichte es, die NADPH-Oxidase als Quelle der stressinduzierten ROS zu identifizierten. Zudem ergab sich ein Zusammenhang zwischen den durch die Dehnung gebildeten ROS und dem intrazellulären Kalzium, da eine Vorinkubation der EBs mit BAPTA-AM die durch die Zugbelastung induzierte ROS Synthese unterdrückte. Die Stressapplikation führte außerdem zu einem Anstieg der NO Bildung in den EBs. Als Quelle konnte hier die eNOS ausgemacht werden, da diese nach 30 min Zugbelastung signifikant phosphoryliert vorlag. Durch die Chelatierung des intrazellulären Kalziums kam es zu einem Rückgang der Phosphorylierung der eNOS und der NO Generierung, was die Beteiligung der CaMK II an der eNOS Phosphorylierung nahelegt.Die Zugbelastung hatte zudem eine Zunahme der Aktivität der MAPK (ERK und JNK) sowie der PI3K zur Folge. Der Anstieg der PI3K Aktivität im Zuge der mechanischen Dehnung konnte durch die Behandlung der EBs mit dem Inhibitor LY-294002 aufgehoben werden. Dies zeigt, dass die als Teil eines mechanosensorischen Komplexes wirkende PI3K für die Transduktion der mechanischen Reize die auf die EBs ausgeübt wurden von Bedeutung ist.

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