Bestimmung der Interferon-gamma-Expression bei Baypamune® behandelten Hunden mittels "Real Time PCR"

Abstract

Der Immunmodulator Baypamune® induziert bei Maus, Mensch und Schwein die IFNg-Expression. Für die Zulassung des lyophilisierten Baypamune® sollte daher untersucht werden, ob auch im Zieltier Hund nach Baypamune®-Applikation eine erhöhte IFNg-Expression nachgewiesen werden kann. Um die IFNg-mRNA-Menge im Hundeblut zu bestimmen, wurde eine Real Time TaqMan® PCR etabliert. Für die Ermittlung eines geeigneten Primer-Sonden-Systems mussten die Exon-Intron-Grenzen der unbekannten caninen IFNg-DNA-Sequenz aufgezeigt werden. Dazu wurde die canine IFNg-mRNA-Sequenz mit den entsprechenden DNA- und mRNA-Sequenzen des Schweines verglichen. Als endogene Kontrolle diente die Co-Amplifikation des Housekeeping-Gens der 18S rRNA. In mehreren Versuchen konnte bestätigt werden, dass die Effizienzen von IFNg- und 18S rRNA-Amplifikation gleich sind. Für die in vitro-Experimente wurden PBMCs aus Hundeblut isoliert und anschließend die RNA extrahiert. Um Beeinflussungen der Zytokinexpression durch Aufarbeitungsschritte ex vivo zu vermeiden, wurde die RNA aus Vollblutproben mit Hilfe eines RNA-stabilisierenden Reagenz (PAXgeneTM) gewonnen. Durch verschiedene Validierungsexperimente konnten Grenzwerte festgelegt werden, anhand derer eine system-unabhängige Ab- oder Zunahme der IFNg-mRNA-Menge beurteilt wurde. Demnach lagen die system-bedingten Veränderungen der mRNA-Menge bei bis zu 2,5fach. Nach in vitro-Stimulation caniner PBMCs mit Baypamune® wurde eine system-unabhängige Zunahme der IFNg-mRNA-Menge gemessen. Allerdings konnte nach in vivo-Applikation des Immunmodulators keine vermehrte IFNg-Expression in caninen Vollblutproben nachgewiesen werden. Auch veränderte Applikationsschemata und die Dosiserhöhung von Baypamune® erbrachten keine veränderten IFNg-mRNA-Mengen bei den untersuchten Hunden. Erst nach wiederholter Baypamune®-Applikation und Impfung konnte bei drei von sechs Hunden eine Reduktion der IFNg-Expression gemessen werden. Dabei kam es in der Placebo-Gruppe bei allen Tieren zu einer Abnahme der IFNg-mRNA-Konzentration. Die PHA-P-Stimulation von PBMCs der untersuchten Tiere ergab bei allen Proben eine erhöhte IFNg-Expression nach Baypamune®- bzw. Placebo-Applikation und Impfung. Am zwölften Versuchstag war die Induktion nur in der Baypamune®-Gruppe signifikant. Die Untersuchung der PBMCs Baypamune®-behandelter und geimpfter Hunde zeigte, dass es auch ohne Zusatz von PHA-P am zwölften Versuchstag zu einer signifikanten Zunahme der IFNg-mRNA-Menge kam. Die Ergebnisse belegen, dass es mit Hilfe der etablierten Real Time TaqMan® PCR möglich ist, system-unabhängige Ab- bzw. Zunahmen der IFNg-mRNA-Mengen in caninen Vollblutproben und PBMCs zu messen. Es wurde gezeigt, dass Baypamune® in vitro die IFNg-Expression in caninen PBMCs induziert. Während Baypamune® in vivo keinen Einfluss auf die IFNg-Expression in caninen Vollblutproben hatte, konnte ein signifikanter Effekt von Baypamune®-Applikation und Impfung auf die IFNg-mRNA-Menge in PBMCs nachgewiesen werden.