Untersuchungen der Blut-Hoden-Schranke während der Rekrudeszenz der Spermatogenese nach Downregulation mittels eines slow release GnRH-Implantates beim Rüden : Expression von Connexin 43, Occludin, Claudin-3, -5 und -11

Abstract

Die Integrität der Blut-Hoden-Schranke (BTB), als wichtiger Faktor für denreibungslosen Ablauf der Spermatogenese, ist in der Literatur bereits eindeutigbeschrieben. Dabei teilt die BTB das Keimepithel der Tubuli seminiferi in ein basalesund ein adluminales Kompartiment und gewährleistet damit den Schutz der primärenSpermatozyten und haploiden Spermatiden vor potenziell schädlichen Substanzendurch eine Passagebehinderung von Molekülen aus dem Interstitium in dasadluminale Kompartiment. Einen maßgeblichen Anteil am Aufbau der BTB habenTight- und Gap-Junctions, welche wiederum aus verschiedenen integralenMembranproteinen lokalisiert zwischen benachbarten Sertoli-Zellen aufgebaut sind.Wie bereits in verschiedenen Spezies nachgewiesen sind besonders das Gap-Junction Protein Connexin (Cx) 43 sowie die Tight-Junction Proteine Occludin(OCLN), Claudin (CLDN) -3, -5 und -11 an der Aufrechterhaltung der Barrierefunktionbeteiligt.Ziel dieser Arbeit war es, die Entwicklung der BTB im Verlauf der Rekrudeszenz derSpermatogenese durch die Untersuchungen von Cx43, OCLN, CLDN-3, -5, und -11auf mRNA-Ebene sowie Cx43 ebenfalls auf Protein-Ebene zu charakterisieren.Hierbei wurde das Modell der Downregulation mittels eines slow release GnRHImplantatesgenutzt, um einen Arrest der Spermatogenese auf Ebene derSpermatogonien bzw. Spermatozyten zu induzieren. Die gewonnenen Daten solltenmit der Situation am juvenilen bzw. am adulten, unbehandelten Hoden verglichenwerden.23 Beagle-Rüden wurden mit einem slow release GnRH-Implant (Gonazon ®, 18,5mg Azagly-Nafarelin) behandelt, welches nach 5 Monaten nach Downregulation derendokrinen und germinativen Hodenfunktion entfernt wurde. Jeweils 3-4 Rüdenwurden im Intervall von 3 Wochen (Wo0-24) chirurgisch kastriert. Die Einteilung derHunde erfolgte zum einen nach dem Zeitpunkt der Kastration (Wo-0, -3, -6, -9, -12und 24) und zum anderen nach histologischen Charakteristika, d.h. den amweitesten entwickelten Keimzellen ( developental groups : DG A (Spermatozyten),DG B (runde Spermatiden), DG C (elongierende Spermatiden) und DG D (elongierteSpermatiden)). Um den Effekt unterschiedlicher GnRH-Agonist Implantate zuuntersuchen, wurden konform mit Woche 0 zudem je 3 Hunde mit Suprelorin®, (4,7mg Deslorelin) bzw. Profact® Depot (6,3 mg Buserelinacetat) behandelt undebenfalls nach 5 Monaten während des Status der Downregulation chirurgischkastriert. Als Kontrollgruppen diente das Hodengewebe von 5 adulten und 3 juvenilenRüden.Auf mRNA-Ebene gelang der Nachweis der Expression für die 5 untersuchten Gene(Cx43, OCLN, CLDN-3, -5 und -11) in allen untersuchten Gruppen mittels RT-PCRund qPCR. Sowohl Cx43 als auch CLDN-11 zeigten in der Wochengruppe (Wo) 3signifikant höhere Werte als in der Wo12, sowie Cx43 ebenso zu Wo24. Für OCLNzeigten sich sowohl im Wochengruppenvergleich eine signifikant geringereExpression in Wo0 und Wo3 verglichen mit Wo6, als auch im DG-Vergleich für DG Averglichen mit DG C, DG D und CG sowie für DG B im Vergleich zu DG D. CLDN-3und -5 zeigten im Wochengruppenvergleich die stärkste Genexpression in Wo0, wassich für CLDN-5 ebenfalls im DG-Vergleich bestätigen ließ.Für Cx43 erfolgte zusätzlich der Nachweis auf Proteinebene, wobei dieImmunhistochemie eine spezifische Färbung zwischen Sertoli-Zellen und zwischenSertoli-Zellen und basal gelegenen Keimzellen ergab. Im Verlauf der Rekrudeszenzder Spermatogenese kam es zu einer Verlagerung des Signals aus dem adluminalenin das basale Kompartiment. In DG C und DG D sowie in den Wo6, -9, -12 und -24zeigte sich wie in CG ein charakteristisches immunhistochemisches Bild mit einerimmunopositiven Reaktion zirkulär oberhalb der Spermatogonien und unterhalb derprimäre Spermatozyten.Die Expression der untersuchten Proteine weist sowohl auf mRNA als auch aufProtein-Ebene auf eine Veränderung bzw. einen Zerfall der BTB im Verlauf derDownregulation hin. In Bezug auf die gewonnenen Ergebnisse scheint eine schnelleWiederherstellung der BTB gegeben und es zeigt sich nach vollständigerRekrudeszenz der Spermatogenese (Wo12, -24) für alle Proteine auf mRNA- und fürCx43 auch auf Proteinebene kein signifikanter Unterschied zu den unbehandeltenKontrollgruppen.Die gewonnenen Ergebnisse weisen eindeutig auf die Funktion von Cx43, OCLN,CLDN-3, -5 und -11 für die BTB beim Hund hin. Während sich durch dieDownregulation signifikante Veränderungen der Proteine im Bereich der BTBergeben, belegen die vorliegenden Daten, dass nach erfolgter Rekrudeszenz derAusgangszustand der ungestörten Spermatogenese mit intakter BTBwiederhergestellt wird, sodass die durch die Anwendung eines slow release GnRHAgonist-Implantates induzierten Effekte nicht nur auf Ebene der Steroidogenese undanhand der morphologischen Charakteristika, sondern auch auf Ebene der BTB alsvollständig reversibel angesehen werden können The integrity of the blood-testis-barrier (BTB) as a major factor for spermatogenesishas already been adressed in literature. The BTB separates the germinal epitheliuminto a basal and an adluminal compartment and protects primary spermatocytes andhaploid spermatids against potentially hazardous substances by inhibitingtransportation of certain molecules from the interstitium into the adluminalcompartment. Tight- and Gap-Junctions consisting of various integral membraneproteins between adjacent sertoli cells are the major component of the BTB. TheGap-Junction protein Connexin (Cx) 43 as well as the Tight-Junction proteinsOccludin (OCLN), Claudin (CLDN) -3, -5 and -11 are predominantly involved in thebarrier function.Aim of the present study was to characterise the mRNA.expression of Cx43, OCLN,CLDN-3, -5, and -11 and protein expression of Cx43 on the development of the BTBduring recrudescence of spermatogenesis. The model of the downregulated testiswas used to induce an arrest of spermatogenesis on the level of spermatogonia andprimary spermatocytes. The results obtained should be compared with the juvenileand the adult canine testis.23 male Beagle were treated with a slow release GnRH-implant (Gonazon®, 18.5 mgAzagly-Nafarelin) which was removed after five months following downregulation ofthe endocrine and germinative testicular function. Three to four dogs each werecastrated at 3-week intervals (week 0-24). Grouping of dogs was according to thetime of castration (week 0, 3, 6, 9, 12 and 24), but also according to histologicalcriteria (the most developed germ cell observed) (developmental groups: DG A,spermatocytes; DG B, round spermatids; DG C, elongating spermatids and DG D,elongated spermatids). To test for the influence of the GnRH-agonist implant 3 dogseach were treated with a Suprelorin® (4.7 mg Deslorelin) or Profact® Depot (6.3 mgbusereline acetate) implant and castrated after 5 months during downregulation. Fiveadult and 3 juvenile male dogs served as controls.The 5 investigated genes (Cx43, OCLN, CLDN-3, -5 und -11) were proven in allgroups using RT-PCR and RT-qPCR. mRNA expression of Cx43 and CLDN-11 wassignificantly higher in week (w) 3 compared to w12 and w24 (the latter Cx43 only).OCLN expression was significantly lower in w0 and -3 compared to w6; besides itwas lower in DG A compared to DG C, DG D and CG as well as for DG B comparedto DG D. For CLDN-3 and -5, gene expression was highest in w0 and DG A (CLDN-5).Cx 43 was also investigated on the protein level with a specific staining beingobserved in immunohistochemistry between sertoli cells and sertoli cells and basalgerm cells. During recrudescence of spermatogenesis, the immunopositive signalwas relocated from the adluminal to the basal compartment. In DG C and -D, w6, -9,-12 and -24 as well as CG the characteristic staining pattern with a staining circularabove the spermatogonia and below the primary spermatocytes was detected.Western Blot was used to verify specificity of the antibody.The expression of the investigated genes on the mRNA and protein level points to adisintegration of the BTB during downregulation. Reorganisation of the BTB occursrapidly with no significant difference being detected following recrudescence (w12,w24) compared to the untreated adult controls. The results obtained underline thefunction of Cx 43, OCLN, CLDN-3, 5 and 11 for the BTB in the dog. Significantchanges occur during downregulation. Following recrudescence, spermatogenesisincluding the BTB recovered completely leading to the conclusion that the effectsinduced by treatment with a slow release GnRH-agonist implant are fully reversible not only regarding steroidogenesis and morphological characteristics as shownbefore- but also regarding the BTB.