Listeria monocytogenes as a vaccine vehicle : generation of attenuated mutants and their immunological characterization

Abstract

The cholesterol-binding cytolysins, listeriolysin O (LLO) as well as pneumolysin (PLY), were expressed in Listeria innocua. Growth in the chemically defined minimal medium resulted in 2-fold increment in the expression of both cytolysins. Purification from supernatant fluids was achieved by ion exchange chromatography. The procedure resulted in about 75 % (LLO) or 70 % (PLY) yield of a hemolytically active, highly purified homogenous proteins.A new and previously uncharacterized target of the humoral immune response, the listerial ferritin protein (Frm), was discovered and characterized. Specific antibodies to Frm are detected in antisera of mice infected with the L. monocytogenes wild type strain but not in antisera of mice infected with a non-pathogenic L. innocua strain. Expression of Frm is both growth phase- and temperature- dependent. Using an isogenic delta frm mutant, ferritin was found to be essential for bacterial growth in minimal media but not in complex media such as BHI. Mutant bacteria also exhibited a defect in intracellular survival. The delta frm strain is hypersensitive to hydrogen peroxide. Mouse infection studies revealed that the listerial ferritin is required for efficacious bacterial growth early in the infectious process. Using the murine listeriosis model, it was investigated whether the induction and expansion of protective and inflammatory T cell responses may be modified by selective manipulation of virulence genes. This was accomplished in two ways; the first was through generation of isogenic Listeria monocytogenes mutant strains that harboured either a specific deletion within the actA gene and/or multiple deletions within the actA and plcB genes while the second way was through the complementation of the non-pathogenic Listeria innocua strain with the PrfA-dependent virulence gene cluster (vgc) of the wild type L. monocytogenes. In comparison to the wild type L. monocytogenes EGD-e strain, the mutant strains were extremely low in virulence and were rapidly eliminated by the host during the first days of infection. Nevertheless, a single immunization with mutant strains has efficiently induced and maintained effector memory CD8+ T cells and provided animals with a state of long-lasting protective immunity against wild type L. monocytogenes. Moreover, these mutants exhibited a significantly reduced ability to induce CD4+ T cell-mediated inflammation. Therefore, they can be used as live vaccines against the corresponding virulent pathogen and as carriers for heterologous antigens . In an attempt to address the role of the pore forming listeriolysin O (LLO) in intracellular survival of L. monocytogenes as well as in mediating a protective T- cell response against the wild type L. monocytogenes strain, two approaches were conducted in this study. Firstly, the structural gene for the related cytolysin pneumolysin (PLY) was cloned on a plasmid vector downstream from the promoter and signal peptide sequences of hly, the gene encoding LLO, and expressed in the isogenic EGD-e hly mutant strain. The resultant recombinant strain secreted active PLY in culture supernatants and was able to escape phagosomes of phagocytic cells in vitro and spread from cell to cell to a limited time after which growth was aborted because of a cytotoxic effect on the host cell. This strain also showed a restricted in vivo survival in a mouse model of listeriosis but was able to protect mice against a lethal dose of the wild type L. monocytogenes and induced a specific T-cell responses against Listeria derived epitopes other than LLO such as the subdominant P60217-225 epitope. The second approach was to study the role of the putative PEST-like sequence, found near the N-terminus of LLO, in virulence and intracellular compartmentalization of the wild type L. monocytogenes strain as well as in induction of a strong cell-mediated protective immunity to the wild type L. monocytogenes. Therefore, the 28 amino acids harbouring the PEST-like sequence at the N-terminus of LLO were deleted and the mutant LLO protein was expressed in a hly-negative isogenic mutant of L. monocytogenes. The mutant protein was secreted in normal amounts in the culture supernatant and was fully haemolytic. L. monocytogenes expressing this truncated LLO showed a reduced capacity to escape the phagosomes of J774 cell line macrophages and showed a 1000-fold decrease in virulence in the mouse model. Moreover, the mutant strain showed a low ability to induce both an early serum level of gamma interferon and gamma interferon-secreting T cells following infection of BALB/c mice and exhibited reduced levels of protection against virulent L. monocytogenes. These results suggest that the PEST-like sequence is crucial for conferring a long lasting immunity against the wild type Listeria monocytogenes through facilitating the bacterial escape into the cytosole of host cells for further processing and antigen presentation. Die Cholesterin-bindenden Cytolysine, Listeriolysin O (LLO) oder Pneumolysin (PLY) in dem apathogenen Stamm L. innocua wurden exprimiert. Die Kultivierung von rekombinanter L. innocua-Stämme im Minimalmedium führte zu einer zweifachen Steigerung der Expression von beiden Cytolysinen. Mit Hilfe der Methode der Ionenaustausch-chromatographie wurden die Proteine aus dem Überstand der Kultur aufgereinigt. Damit erhielt man in etwa 75% (LLO) bis 70% (PLY) Ausbeute von hämolytisch aktiven, mit hochreinen, homogenen Proteinen. Das listerielle Ferritin (Frm) als neuer Angriffspunkt für die humorale Immunantwort nach einer Infektion von Mäusen mit pathogenen L. monocytogenes wurde identifiziert. Spezifische Antikörper gegen Frm werden im Antiserum von mit dem Wildtyp L. monocytogenes infizierten Mäusen nachgewiesen, nicht aber im Antiserum von Mäusen, die mit dem apathogenen Stamm L. inoccua infiziert wurden. Die Expression von Frm war sowohl von Wachstumsphase als auch von Temperaturbedingungen abhängt. Bei der Verwendung einer isogenen Mutante delta frm stellte sich heraus, dass Ferritin für das Bakterienwachstum im Minimalmedium essentiell ist, nicht aber im BHI. Die Deletionsmutante wies außerdem einen Defekt im Überleben innerhalb der Wirtszelle auf Die delta frm ist hypersensitiv gegenüber Wasserstoffperoxid. Versuche am Mausmodell zeigten, dass das listerielle Ferritin für ein effizientes Bakterienwachstum in der frühen Infektionsphase notwendig ist. Mit Hilfe eines Listeriose-Mausmodells, untersucht, ob die Auslösung einer schützenden oder inflammatorischen T-Zell-Antwort durch die selektive Manipulierung von Virulenzgenen modifiziert werden kann. Dies wurde auf zwei Wegen erreicht: Zum Einen erfolgte durch die Herstellung von isogenen Listeria monocytogenes Mutanten, die entweder eine spezifische Deletion im actA Gen und/oder multiple Deletionen im actA Gen und plcB Gen trugen. Zum anderen erfolgte eine Komplementierung eines nicht-pathogenen Stammes Listeria inoccua mit dem PrfA-abhängigen Virulenzgencluster (vgc) eines Wildtyps von L. monocytogenes. Im Vergleich zum wildtypischen L. monocytogenes EGD-e waren die Virulenz der Mutanten extrem herabgesetzt, und sie wurden während der ersten Tage der Infektion rasch von Wirt eliminiert. Dagegen wurde durch die einmalige Immunisierung mit den Mutanten sehr effizient eine Gedächtnis T-Zell-Antwort (CD8+) ausgelöst, die die Tiere mit einem lang-anhaltenden Immunschutz gegen den Wildtyp L. monocytogenes ausstattete. Darüber hinaus war die Fähigkeit der Mutanten signifikant reduziert, eine CD4+- T-Zell- vermittelte Inflammation zu stimulieren. In einem Versuch, die Rolle des Poren-bildenden Listeriolysin O (LLO) beim Überleben von L. monocytogenes in der Zelle als auch bei der Vermittlung einer schützende T-Zell-Antwort gegen den Wildtyp L. monocytogenes zu bestimmen, wurden in dieser Arbeit zwei Ansätze verfolgt. Erstens, wurde das Strukturgen für das ähnliche Cytolysin Pneumolysin (PLY) in ein Plasmid kloniert, downstream vom Promoter und der Sequenz des Signalpeptids von hly, dem für das LLO codierenden Gen, und das Konstrukt wurde in der isogenen EGD-e hly Mutante exprimiert. Der resultierende rekombinante Bakterienstamm sezernierte aktiv PLY in den Kulturüberstand und war im in-vitro Experiment befähigt, den Phagosomen phagozytierender Zellen zu entkommen. Er konnte sich außerdem von Zelle zu Zelle ausbreiten. Der Stamm zeigte zudem im in vivo Versuch mit einem Listeriose-Mausmodell eine verringerte Überlebensrate, er war jedoch zugleich dazu in der Lage, Mäuse gegen eine letale Dosis des Wildtyps von L. monocytogenes zu schützen. In der Maus induzierte der rekombinante Bakterienstamm eine spezifische T-Zellantwort gegen von Listeria-stammende Epitope, und zwar nicht gegen Epitope von LLO sondern solche wie das subdominante p60217-225 Epitop. Der zweite Ansatz war die Untersuchung der Rolle der putativen PEST-ähnlichen Sequenz, die sich nahe des N-Terminus des LLO-Proteins befindet, in Bezug auf die Virulenz und auf die intrazelluläre kompartimentierung des Wildtyps L. monocytogenes, sowohl in Bezug auf die Induktion einer starken zell-vermittelten Immunität gegen den Erreger. Die PEST-ähnliche Sequenz beinhalteten wurden somit deletiert und die LLO Variante wurde in einer hly-negativen isogenen Mutante exprimiert. Das mutierte Protein wurde in normalen Mengen in den Kulturüberstand sezerniert und war in vollem Maße hämolytisch. Der Listerienstamm, der dieses veränderte LLO exprimierte, zeigte eine reduzierte Kapazität den Phagsosomen von Makrophagen zu entkommen, und wies eine tausendfache Senkung der Virulenz im Mausmodell auf. Darüber hinaus zeigte die Mutante eine herabgesetzte Fähigkeit, sowohl ein frühes Serumlevel an -Interferon als auch an -Interferon-sezernierenden T-Zellen zu induzieren, und dadurch kam es zu einem reduzierten Schutz gegen den virulenten Stamm L. monocytogenes.