Influence of peroxisomes on development, maturation and adult functions of the testis

Abstract

Peroxisomes are ubiquitous cell organelles with heterogeneous enzyme composition andfunctions, depending on the metabolic needs of different cell types, tissues and organ systems.However, until the beginning of the experimental work of this thesis hardly any knowledge wasavailable on the metabolic functions of these cell organelles in the testis, despite the well-knownsevere pathological alterations in this organ in patients suffering from peroxisomal diseases. Malechildren with Zellweger syndrome, the most severe form of a peroxisomal biogenesis disorder,exhibit cryptorchism and patients with X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD), a single enzymedefect of a peroxisomal ABC transporter for lipids, show an impairment of testicular functions in80% of the cases.Therefore, the main goals of this thesis were to characterize the peroxisomal distribution andenzyme composition in distinct cell types of normal mouse and human testis and to analyse themolecular consequences of peroxisome deficiency and its influence on male fertility. To get acomplete overview on the peroxisomal compartment and its enzyme composition in the testis innormal mice and on the alterations in scsPex13 knockout mice, routine histological analyses withHE-stained material, Oil red O staining on frozen sections, TUNEL, immunofluorescence andimmunohistochemistry with a variety antibodies against peroxisomal and cell marker proteins,electron microscopy, laser-assisted microdissection (LAMD), isolation of different testicular celltypes and primary cell culture, cell and tissue homogenisation, subcellular fractionation andorganelle isolation, Western blot analysis, lipid extraction, fatty acid and steroid (androgen)analyses by GC-MS, genomic DNA isolation, PCR genotyping, total RNA isolation, RT-PCRanalyses and RNAi on primary Sertoli cells were used.The results of this thesis indicate that peroxisomes in distinct cell types of the testis exhibitspecific enzyme composition and serve divers functions already under normal physiologicalconditions. Despite older reports from the literature on the exclusive presence of these organellesin Leydig cells, in this study peroxisomes were identified with new specific markers in all testicularcell types, including developing germ cells (except for mature spermatozoa). Peroxisomes altertheir matrix protein composition, aggregate in clusters during spermiogenesis in late stages ofelongated spermatids (step 14 to 16) and are transported into the cytoplasmic droplets andresidual bodies, which are subsequently phagocytosed by Sertoli cells. The highest enrichment ofperoxisomal lipid transporters (ABCD1 and ABCD3) as well as of ACOX2, the key regulatoryenzyme of the b-oxidation pathway 2 for side-chain oxidation of cholesterol and medium levels ofcatalase were found in Sertoli cells, suggesting peroxisomes as protectors against lipid toxicityand oxidative stress to prevent germ cell apoptosis. Leydig cells were selectively enriched incatalase and ABCD2, indicating that peroxisomes are important also in this cell type for theprotection of steroidogenesis against ROS and for lipid homeostasis. Comparativeimmunofluorescence analysis revealed that distribution, abundance and enyzme composition ofperoxisomes were conserved between mouse and man.To study the molecular consequences of peroxisomal dysfunction on male fertility, a Sertoli cellspecificknockout mouse was generated by AMH-cre-mediated excision of exon 2 of the Pex13gene, encoding a protein of the docking complex on the peroxisomal membrane involved inmatrix protein import into the organelle. Due to the absence of PEX13 protein and deficient matrixprotein import, all matrix proteins, such as catalase and thiolase, were mislocalized into thecytoplasm in Sertoli cells. Few peroxisomal membrane ghosts, positive for PEX14 were stillpresent in this cell type surrounding large lipid droplets. Within 130 days of postnataldevelopment, the scsPex13KO animals developed a complete Sertoli cell only syndrome. TUNELpreparations of paraffin sections revealed that germ cell apoptosis occurred between 90 and 130days of postnatal development. A strong increase of neutral lipids, such as triglycerides andcholesteryl esters was observed in Sertoli cells of the seminiferous tubules of P130 scsPex13KOanimals. The accumulation of peroxisome-metabolised fatty acids (VLCFA, pristanic and phytanicacid) in frozen testis samples suggested the deficiency of peroxisomal a- and b-oxidation. Steroidmeasurements revealed normal testosterone levels, but a strong accumulation ofdehydroepiandrosterone (DHEA) and a decrease of all other androgen precursors, suggesting ablock of the D5 pathway in these animals. The expression of mRNAs for the FSH- and LHreceptorswas significantly increased and the ones for transcription factors (Sf1, Gata4) andenzymes for steroidogenesis (Star, Cyp450scc, Cyp450c17, 3b-Hds) were elevated in Sertolicells as well as in Leydig cells of scsPex13KO mice. Specific Sertoli cell markers were alsoenhanced (Inha, Trf, Sgp2). Strongly proliferated Leydig cells seemed to dramatically upregulatetheir peroxisomal compartment and exhibited a strong increase of peroxisomal ABCDtransporters.Ultrastructural analysis of different subcellular compartments revealed mitochondriawith rearrangement of their cristae and giant whorl-like structures of SER in Leydig cells.Mitochondria in Sertoli cells were proliferated and exhibited extremely high levels of SOD2.Strong ROS production and a similar increase in mitochondrial SOD2 were detected in primarySertoli cells with a siRNA-mediated knockdown of the Pex13 gene. Peroxisomal dysfunction inSertoli cells led to an induction of constitutive and inducible cyclooxygenases (COX1, COX2),production of pro-inflammatory cytokines (Il1a, Il6, Tnfa, Mif) and local testicular inflammation,showing infiltration of macrophages in the interstitial space of the testis in scsPex13KO animals.In conclusion, peroxisomes in Sertoli cells are essential organelles in the testis for male fertilitywhich (1) regulate lipid homeostasis in the seminiferous tubules, (2) protect spermatogenesisagainst oxidative stress due to ROS increase, (3) are involved in androgen precursor synthesisand keep androgens in balance, and (4) protect against inflammation through the degradation ofbioactive lipid mediators (e.g. arachidonic acid or eicosanoids).Since peroxisomal enzyme composition is similar between mice and humans, scsPex13 knockoutmice provide an excellent model system to study human infertility due to peroxisomal deficiency.Future studies on tissue samples from infertile patients are needed to clarify in which extentperoxisomes are involved in the pathogenesis of idiopathic infertility. Peroxisomen sind ubiquitäre Zellorganellen, die abhängig von metabolischen Anforderungen inunterschiedlichen Zelltypen, Geweben und Organsystemen eine heterogeneEnzymzusammensetzung und unterschiedliche Funktionen aufweisen. Über die metabolischeFunktion dieser Organellen im Hoden standen zu Beginn der experimentellen Arbeiten zu dieserDissertation jedoch kaum Informationen in der Literatur zur Verfügung, obwohl ausgeprägtepathologische Veränderungen in diesem Organ bei Patienten mit peroxisomalen Krankheitenauftreten. So weisen Knaben mit Zellweger-Syndrom, der schwersten Form eines peroxisomalenBiogenesedefektes, Kryptorchismus auf und Patienten mit X-chromosomalerAdrenoleukodystrophie (X-ALD), einem Einzelgendefekt eines peroxisomalen ABC-Transportersfür Lipide, zeigen in 80% der Fälle eine Beeinträchtigung der testikulären Funktion.Deshalb bestanden die Hauptziele dieser Dissertation darin, die Verteilung undEnzymzusammensetzung der Peroxisomen in verschiedenen Zelltypen des Hodens der Mausund des Menschen im Vergleich zu charakterisieren sowie die molekulare Pathogenese derdurch Peroxisomendefizienz ausgelösten Veränderungen zu analysieren und deren Einfluss aufdie männliche Fertilität nachzuweisen. Um einen Überblick über das peroxisomale Kompartimentim Hoden von Wildtyp-Mäusen und über die Veränderungen in Sertolli-Zell-spezifischen Pex13Knockout-Mäusen (scsPex13KO) zu erhalten, wurden folgende Methoden in dieser Dissertationetabliert und angewandt: Morphologische Analyse HE-gefärbter histologischer Präparate,Ölrot O-Färbung von Gefrierschnitten, TUNEL, Immunofluoreszenz und Immunohistochemie mitunterschiedlichen Antikörpern gegen peroxisomale und zelltypspezifische Markerproteine,Elektronenmikroskopie, lasergestützte Mikrodissektion, Isolierung und Kultivierung verschiedenerprimärer Zellen aus Hodengewebe, Western-Blot-Analysen, Lipidextraktion, Fettsäure- undSteroidanalysen mittels GC-MS, Isolierung genomischer DNA und PCR-Genotypisierung,Isolierung von Gesamt-RNA und RT-PCR Expressionsanalysen, RNAi-Knockdown des Pex13Gens in primären Sertolizellen, ROS-Nachweis an primären Sertoli-Zellen mittels DHEFluoreszenz.Die Resultate dieser Dissertation zeigen eindeutig, dass Peroxisomen in den spezifischenZelltypen des Hodens schon unter physiologischen Bedingungen unterschiedlicheEnzymzusammensetzung besitzen und verschiedene Funktionen erfüllen. Im Gegensatz zuLiteraturangaben über das Vorkommen der Peroxisomen ausschließlich in Leydig-Zellen wird inder vorliegenden Dissertation die Existenz dieser Zellorganellen in allen Zelltypen des Hodens,sogar in Keimzellen (mit Ausnahme gereifter Spermien), nachgewiesen. Peroxisomen ändernihre Matrixproteinzusammensetzung und clustern (bilden Gruppen) im Verlauf derSpermiogenese in späten Stadien elongierter Spermatiden (Stadium 14-16); sie werden inResidualkörper transportiert und durch anschließende Phagozytose in Sertolizellen abgebaut. Diehöchste Anreicherung der peroxisomalen Lipidtransporter ABCD1 und ABCD3 sowie von ACOX-2, des Schlüsselenzyms des 2. b-Oxidationswegs zur Seitenkettenoxidation von Cholesterin und auch ein relativ hohes Katalasevorkommen wurden in Sertoli-Zellen nachgewiesen. Dies deutetdarauf hin, dass Peroxisomen in Sertoli Zellen vor Lipidtoxizität und oxidativem Stress schützen.Leydig-Zellen dagegen waren besonders mit Katalase angereichert und enthielten auch hoheMengen ABCD2. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass Peroxisomen in diesen Zellen dieSteroidbiosynthese vor den toxischen Wirkungen von ROS schützen und die Lipidhomöostaseregulieren. Vergleichende Immunofluoreszenzanalysen von murinen und humanen Probenerbrachten, dass sich Verteilung, Menge und Enzymzusammensetzung der Peroxisomenzwischen den beiden Spezies nicht grundsätzlich unterscheiden.Um die molekularen Konsequenzen peroxisomaler Dysfunktion auf die männliche Fertilität zuuntersuchen, wurde eine Sertoli-Zell-spezifische Knockout-Maus durch AMH-cre vermittelteExzision des Exons 2 des Pex13-Gens hergestellt. Das Pex13-Gen kodiert ein Protein desDocking-Komplexes der Peroxisomenmembran, das in den Matrixproteinimport eingeschaltet ist.Durch das Fehlen des PEX13-Proteins (PEX13p) blieben alle peroxisomalen Matrixproteine, wiez.B. Katalase und Thiolase, im Zytoplasma der Sertoli-Zellen fehllokalisiert. Einige wenigePex14p-positive peroxisomale Membranreste ( ghosts ) waren um große Lipidtropfen herumdetektierbar. Innerhalb von 130 Tagen in der postnatalen Entwicklung bildeten die scsPex13-Knockout-Mäuse ein komplettes Sertoli cell only -Syndrom aus. In TUNEL-Präparationen vonParaffinschnitten konnte der Keimzellverlust durch Apoptose innerhalb des Zeitraums zwischen90 und 130 Tagen in der postnatalen Entwicklung nachgewiesen werden. ScsPex13 Knockout-Mäuse (P130) wiesen einen starken Anstieg neutraler Fettsäuren und von Cholesterinestern inSertoli-Zellen der Tubuli seminiferi auf. Der Nachweis der Akkumulation vonperoxisomenspezifischen Fettsäuren (sehr langkettige Fettsäuren, Pristan- und Phytansäure) inGefrierschnitten ließ weiterhin eine Defizienz von peroxisomaler a- und b-Oxidation vermuten,was durch die Fehllokalisation von ACOX1 und Thiolase erklärt werden konnte. Steroidanalysenerbrachten normale Testosteronspiegel, jedoch eine starke Erhöhung vonDehydroepiandrosteron (DHEA) und die Verminderung aller anderen Androgenvorläufer, wasdurch eine Blockierung des D5-Stoffwechselweges auf Höhe der peroxisomalen17b-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (multifunktionelles Protein 2 = MFP2) in diesen Tierenerklärbar ist. Eine signifikante Erhöhung der mRNA-Expression der FSH- und LH-Rezeptorensowie der Transkriptionsfaktoren (Sf1, Gata4) und der Enzyme für die Steroidsynthese (Star,Cyp450scc, Cyp450c17, 3bHsd) wurde in Sertoli- und in Leydig-Zellen festgestellt. Auch diemRNAs spezifischer Sertoli-Zell-Marker waren induziert (Inha, Trf, Sgp2). Die stark proliferiertenLeydig-Zellen des Interstitiums wiesen eine Vermehrung des peroxisomalen Kompartiments aufund zeigten eine starke Erhöhung der Proteinmenge von peroxisomalen ABC-Transportern. Dieultrastrukturelle Analyse verschiedener subzellulärer Kompartimente in diesen Zellen erbrachteMitochondrien mit veränderten Cristae und große schneckennudelartige ( whorl-like ) Aggregatedes glatten ERs. Mitochondrien in Sertoli-Zellen wurden vermehrt aufgefunden und enthieltenhohen Mengen vonn SOD2. Eine starke Induktion der ROS-Produktion und eine Erhöhung derZusammenfassung149 / 169SOD2 konnten experimentell auch durch siRNA-ausgelösten Knockdown des Pex13-Gens inprimären Sertoli-Zellen ausgelöst werden. Weiterhin führte die peroxisomale Dysfunktion inSertoli-Zellen zu einer Induktion der konstitutiven und induzierbaren Formen derCyclooxygenasen (COX1, COX2), zu der vermehrten Produktion von proinflammatorischenCytokinen (Il1a, Il6, Tnfa, Mif) und einer Hodenentzündung mit Makrophageninfiltration imInterstitium in scsPex13 Knockout-Mäusen.Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Peroxisomen in Sertoli-Zellen essentielleZellorganellen zur Erhaltung der männlichen Fertilität darstellen, die 1) die Lipidhomöostase inTubuli seminiferi regulieren, 2) die Spermatogenese gegen oxidativen Stress durch Erhöhung vonROS schützen, 3) in die Androgensynthese eingeschaltet sind und das Androgengleichgewichtregulieren und 4) vor Entzündungen des Hodens durch den Abbau von bioaktivenLipidmediatoren (z.B.: Arachidonsäure und Eicosanoide) schützen.Da eine ähnliche Enzymzusammensetzung im Hoden der Maus und des Menschennachgewiesen werden konnte, stellen die scsPex13 Knockout-Mäuse ein ideales Modellsystemzum Studium männlicher Infertilität durch peroxisomale Dysfunktion dar. Zukünftige Studien mitGewebeproben von infertilen Patienten sind jedoch notwendig, um aufzuklären, welche Rolle derperoxisomale Stoffwechsel in der Pathogenese von idiopathischer Infertilität beim Mann spielt.