Bone marrow transplantation of CD117+ (c-Kit) stem cells and investigation of the bile acid transporter regulation in Abcb4-/- mice, a model of sclerosing cholangitis

Abstract

Abcb4 (ATP-binding cassette sub family-b) or Mdr2 (multidrug resistance protein 2) is a gene which encodes for ABCB4 protein that mediates the transportation of phospholipids across the canalicular membrane of hepatocytes into the bile. Functional loss of the ABCB4 transporter disturbs the excretion of phospholipids into bile, leading to toxic bile composition, bile duct alterations, and damaged bile duct epithelia resembling sclerosing cholangitis (1). Long term consequences are biliary cirrhosis, cholangiocarcinoma and liver failure (2).In Abcb4-/- mice, a model of sclerosing cholangitis, we aimed to investigate the regenerative potential of bone marrow transplantation (BM-Tx) and especially BM-Tx of desialylated CD117+ (c-Kit) stem cells. CD117 receptor expressing cells are hematopoietic progenitors, which bear the potential to differentiate into specialized cell types depending upon tissue environment. Based on these characteristics we analysed whether CD117+ cells differentiated into hepatocytes, e.g. by by cell fusion (3).Successfully isolated mouse (BALB/c-GFP) hematopoietic stem cells were sorted with the help of hematopoietic (Lin- CD117+) cell surface markers. Neuraminidase treated CD117+ progenitor cells were transplanted into lethally irradiated Abcb4-/- (BALB/c-GFP → BALB/c-Abcb4-/- allogenic transplantation) mice at the age of 6-7 weeks. At respective time points (i.e 2 and 20 weeks after transplantation, actually 8 and 26 weeks of age) mice were sacrificed and underlying immunomodulatory and matrix remodelling processes were analyzed. In addition, we elucidated molecular and biochemical analysis of hepatic bile acid transport in Abcb4-/- mice during the course of the disease. The present studies demonstrated a reduced temporary graft versus host disease and unaltered liver integrity. Fusion of transplanted (GFP+) cells with host (Abcb4-/-) hepatocytes was a rare event. Whereas lots of GFP+ cells, including T-cells infiltrated around portal fields could be detected. Significant upregulation of proinflammatory (Th1) and profibrogenic (Th2) cytokines revealed enhanced fibrosis in the longterm observation. Furthermore, bile acid transporter data revealed an altered gene regulation at basolateral and canalicular membrane in chronically injured liver of Abcb4-/- mice.The present work suggests that transcriptional changes of bile acid transporters may open new molecular targets for therapy of liver fibrosis in Abcb4-/- mice. These data from fibrogenesis in Abcb4-/- mice are of great interest for translational antifibrotic strategies. Abcb4 (ATP-Bindungs-Cassette-Unterfamilie-b) auch bekannt als Mdr2 (multidrug resistance protein 2) ist ein Gen, das für das ABCB4 Protein, das den Transport von Phospholipiden für die kanalikuläre Membran der Hepatocyten in die Galle vermittelt, codiert. Ein Funktionsverlust der ABCB4 Transporter stört die Ausscheidung von Phospholipiden in die Galle und führt zu einer toxischen Zusammensetzung der Galle, Gallengangsveränderungen und beschädigtem Gallengangsepithel, was einer sklerosierenden Cholangitis ähnelt (1). Langfristige Folgen sind biliäre Leberzirrhose, Gallengangskarzinom und Leberversagen (2). In Abbc4-/- Mäusen, einem Modell der sklerosierenden Cholangitis, wollten das regenerative Potenzial der Knochenmarkstransplantation (BM-Tx) und vor allem BM-Tx desialylierten CD117+(c-Kit) Stammzellen zu untersuchen. CD117-Rezeptor exprimierende Zellen sind hämatopoetische Vorläuferzellen, die das Potenzial in spezialisierte Zelltypen je nach Gewebeumgebung unterscheiden zu tragen. Basierend auf diesen Eigenschaftenhaben wir untersucht, ob CD117+ Zellen in Hepatozyten differenzieren können, z. B. durch Zellfusion (3). Erfolgreich aus einer Maus (BALB/c-GFP) isolierte hämatopoetische Stammzellen wurden mit Hilfe von hämatopoetischen (Lin- CD117+) Zelloberflächenmarker aussortiert. (BALB/c-GFP → BALB/c-Abcb4-/- allogene Transplantation) Mäuse im Alter von 6-7 Wochen - Neuraminidase CD117+ Vorläuferzellen wurden in letal bestrahlten Abcb4-/- transplantiert. An den jeweiligen Zeitpunkten (2 und 20 Wochen nach der Transplantation, eigentlich 8 und 26 Wochen alt) wurden die Mäuse getötet und die zugrunde liegenden immunmodulatorischen und Matrix-Umbauprozesse wurden analysiert. Darüber hinaus führten wir molekulare und biochemische Analysen von Leber-Gallensäure -Transport in Abcb4-/- Mäusen im Verlauf der Erkrankung durch. Die vorliegenden Studien zeigten eine reduzierte temporäre Graft-versus-Host-Krankheit und unveränderte Leberintegrität. Die Fusion von transplantierten (GFP+) Zellen mit Host (Abcb4-/-) Hepatozyten war ein seltenes Ereignis. Während könnten viele GFP+ Zellen, einschließlich T-Zellen um Portalfeldern infiltriert erkannt werden. Bedeutende Hochregulation proinflammatorischer (Th1) und profibrogenen (Th2) Zytokine zeigte verbesserte Fibrose in der langfristigen Beobachtung. Darüber hinaus offenbaren die Gallensäure-Transporter-Daten eine veränderte Genregulation der basolateralen Membran und kanalikulären bei chronisch verletzte Leber Abcb4-/- Mäusen.Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Transkriptionsänderungen von Gallensäure- Transportern neue molekulare Ziele für die Therapie von Leberfibrose in Abcb4-/- öffnen Mäusen sein können. Diese Daten aus Fibrose in Abcb4-/- Mäuse sind von großem Interesse für translationale antifibrotischen_Strategien.