Nachweis von PAK-metabolisierenden Mikroorganismen durch kulturelle und molekularbiologische Verfahren

Abstract

Zielsetzung der Arbeit war der Nachweis von PAK-abbauenden Mikroorganismen in Umweltproben mittels klassischer mikrobiologischer Arbeitstechnikenund molekular-biologischer Methoden. Durch selektive Anreicherung wurden Bakterien mit der Fähigkeit Polyzyklische Aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) abzubauen, in aquatischen undterrestrischen Umweltproben nachgewiesen. Unabhängig von der Belastung der Standorte mit PAK wurden aus allen untersuchten Habitaten Bakterien isoliert,die mit Naphthalin oder Phenanthren als alleiniger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen konnten. Die 23 isolierten PAK-abbauenden Bakterien konnten als Mitglieder der Gattungen Sphingomonas, Acidovorax, Comamonas, Pseudomonas,Rhodococcus und Paenibacillus identifiziert werden und waren somit den alpha-, beta- und gamma-Subklassen der Proteobakterien und denEntwicklungslinien der grampositiven Bakterien mit hohem und niedrigem GC-Gehalt der DNA zuzuordnen. Die größte Gruppe bildeten mit 10 der 23 IsolateVertreter der Gattung Pseudomonas, die alle Naphthalin metabolisierten. Die Quantifizierung des Naphthalin-Abbaus mittels gaschromatographischer Verfahren zeigte, daß in Flüssigmedium vorhandenes kristallines Naphthalin(0,05%, w/v) von den meisten Stämmen nach nur zwei Tagen Kultivierungsdauer vollständig metabolisiert wurde. Die getesteten Rhodococcus Isolate bautenNaphthalin wesentlich langsamer ab, als die verschiedenen Isolate, die den Proteobakterien zugeordnet wurden. Der dreikernige Aromat Phenanthren wurdevon den getesteten Bakterienstämmen langsamer abgebaut als Naphthalin. Innerhalb von fünf Tagen wurde die Phenanthrenmenge im Medium auf 40-60% derAusgangsmenge reduziert. Die Untersuchung des Naphthalinabbaus durch Zellen, die zuvor in Naphthalin-haltigem Medium bzw. in Vollmedium vorkultiviert worden waren, ergab, daßdie Enzyme für den Abbau von Naphthalin in Abwesenheit eines Induktors nicht exprimiert wurden. Ebenso zeigte sich, daß Zellen, die in Medium mitNaphthalin oder Phenanthren kultiviert wurden, wesentlich höhere Catechol 2,3-Dioxygenase (C23O)-Aktivitäten aufwiesen als in Voll-medium gewachseneZellen. Zum Nachweis von PAK-Abbauern auf molekulargenetischer Ebene wurden, basierend auf bekannten Sequenzen, PCR-Primer und Oligonukleotidsonden fürcodierende Abschnitte der C23O entwickelt, und, in Kombination mit Primern und Oligonukleotidsonden, zur Detektion der initialen PAK-Dioxygenase(entwickelt von R. Moser, TU-Berlin), eingesetzt. Mit den entworfenen Primern und Sonden konnten die C23O-Sequenzabschnitte bei allen PAK-abbauenden Referenzstämmen und Isolaten, die der GattungPseudomonas und Sphingomonas zugehörten, spezifisch detektiert werden. Durch die Anwendung spezifischer Primer und Sonden konnten dabei die Geneder C23O für Vertreter der Pseudomonaden und Sphingomonaden getrennt voneinander erfaßt werden. Sequenzanalysen der erhaltenen PCR-Amplifikate zeigten, daß die C23O-Gene innerhalb der Gattungen Pseudomonas bzw. Sphingomonas mit über 75%Sequenzähnlichkeit sehr gut konserviert sind. Dagegen waren Sequenzen der katabolischen Gene der PAK-abbauenden Comamonas-, Acidovorax- oderRhodococcus-Vertreter offensichtlich zu verschieden, verglichen mit den Pseudomonas- und Sphingomonas-Sequenzen, um sie mittels der entwickeltenPrimer und Sonden detektieren zu können. Die Diversität der C23O zeigte sich auch bei der spezifischen enzymatischen Aktivität, die im Bereich von 0,1 bis650 mU mg-1 Protein variierte. Dabei wurde die höchste spezifische Aktivität für verschiedene Pseudomonas-Stämme nachgewiesen. Die entwickelten Primer wurden auf ihre Anwendbarkeit getestet, PAK-abbauende Bakterien in Umweltproben kultivierungsunabhängig zu detektieren.Verschiedene DNA-Isolierungsmethoden und Techniken zur Aufreinigung der isolierten DNA wurden getestet und variiert. Bei der DNA-Isolierung ausBelebtschlammproben wurden Substanzen coextrahiert, die stark hemmenden Einfluß auf die PCR hatten. Die weitere Aufreinigung der DNA führte zu starkenVerlusten der ursprünglichen DNA-Mengen und damit zu einer Reduzierung der zu detektierenden Zielsequenzen. Die extrahierte und gereinigte DNA aus unterschiedlichen Belebtschlammproben wurde in der PCR zur Detektion von initiale Dioxygenase- undC23O-codierenden Genabschnitten eingesetzt. Während codierende Bereiche der initialen Dioxygenase in der Belebtschlammprobe der Kläranlage Gießen mitden entwickelten Primern nachgewiesen werden konnten (R. Moser, TU-Berlin), wurden bei der Verwendung der C23O-spezifischen Primer keinePCR-Amplifikate erhalten. Offensichtlich lag die Zahl der C23O-Zielsequenzen in den untersuchten Umweltpoben unterhalb des Detektionslimits. In derextrahierten DNA aus anderen Belebtschlammproben konnten C23O-codierende Abschnitte detektiert werden. Die erhaltenen PCR-Amplifikate waren aberin allen Fällen sehr schwach. Die Ergebnisse zeigen, daß zur Detektion von katabolischen Genen, die in geringen Konzentrationen in Umweltproben vorliegen,spezielle Methoden zur Aufreinigung der DNA-Rohextrakte etabliert werden müssen.