Struktur und Funktion der Oberflächenproteine von ungewöhnlichen Hepatitis B Virus-Varianten

Abstract

Hepatitis B Virus (HBV) ist eines der wichtigsten humanpathogenen Viren. Da HBV schwierig zu untersuchen ist werden oft Modellviren aus derselben Familie (Hepadnaviridae) verwendet. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden natürlich auftretende Virus-Varianten im Genus Orthohepadnavirus näher charakterisiert. Dazu wurden zunächst Genom-Abschnitte des Arktischen Hörnchen Hepatitis Virus (ASHV) kloniert, sequenziert und dann einer Sequenzanalyse unterzogen. Es wurden zwei ASHV-Seren untersucht, von denen die eine Probe aus einem chronisch mit ASHV infizierten Arktischen Hörnchen stammte (ASHV3P), die andere aus einem experimentell, akut mit ASHV infizierten Waldmurmeltier (ASHV3537). Die beiden Klon-Sequenzen unterschieden sich auf Nukleotidebene nur um 0,3 %, so dass die Notwendigkeit einer Anpassung an den neuen, phylogenetisch verwandten Wirt (Waldmurmeltier) weitgehend ausgeschlossen werden konnte. Die Nukleotid-Differenz der beiden Klone ASHV3P und ASHV3537 zur publizierten Sequenz ASHVAGU29144 [Testut et al., 1996] lag dagegen überraschenderweise bei 13,0 % bzw. 12,9 %. Daher handelte es sich um einen neuen Genotyp des ASHV, der vom zuerst beschrieben Genotyp fast so weit entfernt war wie von den entsprechenden Viren in Waldmurmeltieren (WHV) oder Erdhörnchen (GSHV).Im zweiten Teil der Arbeit wurden Quasispezies von HBV-Varianten bei okkulter Hepatitis B Infektion (OBI) in 14 Serumproben analysiert. Die OBI ist ein zunehmendes Problem bei der Sicherheit von Blutspenden und bei der immunsuppressiven Behandlung von Patienten. Sie zeichnet sich durch Nichtnachweisbarkeit der, an sich vorhandenen, HBV-Surface-Proteine aus. Die Gründe dafür sind nicht genau bekannt, eine Immunselektion von Mutanten wird vermutet. Es wurde hier nachgewiesen, dass die Mutationsrate im offenen Leserahmen der HBV-Surface-Proteine (S-ORF) höher lag als im überlappenden Polymerase-ORF. Es wurde eine besonders hohe Variabilität in der Antigen-Schleife der HBV-Surface-Proteine detektiert (4,43 %-14,43 %), während die für die Virusanheftung essenzielle PräS-Domäne im Vergleich stärker konserviert war (0,83 %-2,86 %). Daraus resultierte eine 19 bis 62 Mal höhere Variabilität für die HBsAg-Schleife bei den OBIs als bei normalen HBsAg-positiven HBV-Infektionen. Es wurde eine Reihe von escape-Mutanten identifiziert, obwohl die Proben keinen messbaren protektiven Antikörper (anti-HBs) enthielten. Dennoch kann von einer gerichteten Selektion im S-ORF ausgegangen werden, da die Differenzierung in synonyme und nicht-synonyme Substitutionen eindeutig gezeigt hat, dass sich die Mehrheit der Mutationen direkt auf die AS-Sequenz des S-ORF auswirkt. Das Virus versucht also der Immunkontrolle des Wirtes durch Veränderungen der variierbaren B-Zell-Epitope in den Surface-Proteinen zu entgehen.Im letzten Teil der Arbeit wurden zum einen HBV-Konstrukte in einem etablierten Zellkultursystem exprimiert, zum anderen wurde versucht die HBV-Infektion mit affinitätsgereinigten, neutralisierenden Antikörpern im Primären Tupaia Hepatozyten -Infektionssystem zu inhibieren. Eine vollständige Inhibition der HBV-Infektion wurde allerdings nur bei Konzentrationen von 30 mIU/ml anti-HBs einer vakzinierten Person erreicht. Hepatitis B Virus (HBV) is one of the most important human pathogenic viruses. Due to difficulties in the investigation of HBV it is common to use model systems of the same family (Hepadnaviridae). In the first part of this thesis naturally occurring viral variants of the genus Orthohepadnavirus were characterised. For this purpose genome fragments of the Arctic Squirrel Hepatitis Virus (ASHV) were cloned, sequenced and subsequently analysed. Two sera of ASHV were investigated, one from a chronically ASHV-infected Arctic squirrel (ASHV3P) and another from an acute experimentally ASHV-infected woodchuck (ASHV3537). Both sequences diverged only by 0.3% on the nucleotide-level so that the necessity of an adaptation to the phylogenetically related host (woodchuck) can for the most part be ruled out. Surprisingly, the differences in nucleotides between the two ASHV-clones and the published ASHVAGU29144 sequence were about 12.9% and 13.0%, respectively. Hence a new ASHV genotype was identified, which is almost as far removed from the published ASHV genotype as the corresponding viruses of the woodchuck (WHV) or the Ground Squirrel (GSHV).In the second part of the thesis viral quasispecies of HBV variants during an occult HBV infection (OBI) were analysed in 14 serum samples. OBI is a severe problem for safety in blood donations and immune suppressive therapy of patients. It is characterized by the non-detectability of existent HBV surface proteins. The reasons are not fully known but an immune selection of mutants is assumed. In this study the mutation rate of the surface protein open reading frame (S-ORF) was shown to be higher than in the overlapping polymerase-ORF. Within the antigenic loop of the HBV surface proteins a particularly high variability was detected (4.43% - 14.43%), whereas the preS-domain, which is essential for virus adsorption, showed a comparatively higher degree of conservation (0.83% - 2.86%). Hence, in the case of OBI the antigenic loop shows a variability 19 to 62 times higher than normal HBsAg positive HBV infections. A number of escape mutations were identified, although the samples did not contain detectable protective antibodies (anti-HBs). However, a directed selection process on the S-ORF can be expected, because the differentiation into synonymous and non-synonymous substitutions demonstrated that the majority of substitutions had an effect on the amino acids of the S-ORF. The virus attempts to escape the host immune control by altering the variable B-cell epitopes of the surface proteins. The aim of the last part of this study was to express HBV-constructs in established cell culture systems and to inhibit the HBV infection in primary Tupaia hepatocytes by affinity-purified, neutralising antibodies. A complete inhibition of the HBV infection was only achieved by using anti-HBs from a vaccinated person at concentrations of 30 mIU/ml.