Veränderung der Erkennungsspezifität ausgewählter Restriktions-Modifikationssysteme aus dem Bodenbakterium Herpetosiphon giganteus

Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war es, die natürliche Bildung eines neuen Restriktions-Modifikationssystem anhand des Beispiels der als nicht klonierbar geltenden S176N Mutante des Restiktionsenzyms R.HgiBI nachzuahmen. Die Nichtklonierbarkeit dieser Mutante sollte dabei entweder durch eine neue Spezifität oder durch eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Aktivität hervorgerufen werden, die nicht mehr durch die Methyltransferase M.HgiBI abgedeckt wird.Als Untersuchungsobjekt boten sich die drei sehr nahe miteinander verwandten RM-Systeme RM.HgiBI. RM.HgiCII und RM.HgiEI an. In Gegenwart verschiedener Varianten der Methyltransferase M.HgiBI gelang es, die gesuchte S176N auch für R.HgiBI herzustellen. Ferner gelang es dieselbe vorher nicht erhaltene Mutante herzustellen, wenn neben einer der beiden Methyltransferasen M.HgiBI oder M.HgiEI auch noch ein kleiner offener Leserahmen (orfC) aus den RM-Operon anwesend war. Dieser sog. control orfC wurde bisher nur bei der Klonierung von R.HgiEI und R.HgiCII benötigt. Es wird daher spekuliert, dass dieser OrfC die Expressionsrate der Methyltransferasen positiv beeinflusst.Sowohl die Spezifität als auch die Aktivität der Methyltransferasen konnte durch die intensive Nutzung der DNA-Sequenzierung nach Bisulfit-Behandlung aufgeklärt werden. Während sowohl M.HgiBI als auch M.HgiEI neben der Haupterkennungssequenz GGWCC auch die verwandte Sequenz GGSCC methyliert, während die dritte Methyltransferase M.HgiCII diese Aktivität nicht zeigt. Umgekehrt ist M.HgiCII aber deutlich aktiver in der Methylierung der Hauptsequenz GGWCC. Schließlich wurden die drei Endonuklease mit einer speziell entwickelten Strategie darauf untersucht, ob sie neben der Haupterkennungssequenz auch andere Sequenzen erkennen. Die Verwendung eines sehr bequemen Expressionsassays für das grün fluoreszierende Protein GFP ließ schnell erkennen, dass die beiden Endonukleasen R.HgiCII und R.HgiEI keinerlei zusätzliche Spezifitäten besitzen. Nur R.HgiBI zeigt eine zusätzliche Aktivität, bei der die Sequenz GAACC spezifisch geschnitten wird. Durch Zufall wurde das Gen für die Methyltransferase M.HgiBI in zwei Proteine aufgeteilt. Während die Fähigkeit die Sequenz GGSCC zu methylieren verloren ging, konnte nun die bei der zugehörigen Endonuklease gefundene Sequenz GAACC methyliert werden. Die bis dato nicht erhaltene Mutante R.HgiBI S176N konnte in vier Fällen hergestellt werden. Es stellte sich heraus, dass deren Klonierung nur mit starken Methyltransferase-Varianten möglich ist. Das beweist, dass die Nichtklonierbarkeit dieser Mutante auf der Stärke der Endonuklease beruht. The aim of this work is to simulate the natural formation of a new Restriction-Modification-System (RM-system) by cloning the S176N mutant of restriction endonuclease R.HgiBI, which could not be achieved by other authors, before. The reason for this failure should either be the gaining of a new specificity or an increased activity, which cannot be controlled by the wildtype methyltransferase M.HgiBI, anymore.The three closely related RM-Systems RM.HgiBI. RM.HgiCII and RM.HgiEI were used as wildtype references. Using several variants of the methyltransferase M.HgiBI it was possible to isolate the mutant in demand R.HgiBI S176N. In addition, this mutant could be obtained in the presence of either M.HgiBI or M.HgiEI in the presence of a small open reading frame called orfC for control orf. This orfC was shown to be necessary for cloning both the RM.HgiEI and the RM.HgiCII system, before. Controlling the expression of the wildtype R.HgiBI it was not needed, but for cloning the S176N mutant thereoff. Thus, it is speculated, that the orfC increases the expression rate of the respective methyltransferase.Using bisulfite-sequencing the activity as well as the specificity of the respective methyltransferases has been investigated thoroughly. It turned out, that both the methyltransferases M.HgiBI and M.HgiEI possess the capability to methylate the sequence GGSCC in addition to the main target sequence GGWCC, while the third methyltransferase M.HgiCII lacks this capability. However, this third methyltransferase is more active in methylating the main target sequence GGWCC. Thereafter, the endonucleases have been checked for side activities by a newly developed strategy using the fairly convenient expression of the green fluorescence protein GFP. While the endonucleases R.HgiCII and R.HgiEI did not show any additional specificity, R.HgiBI shows an additional activity in cutting the GAACC sequence. By chance the methyltransferase M.HgiBI has been split into two separate proteins. While the capability to methylate the GGSCC sequence was lost, the GAACC could now be methylated by this enzyme. We could produce the seemingly unclonable mutant R.HgiBI S176N by using four different variants of methyltransferases. It was possible to clone this endonuclease mutant with variants of methyltransferases that were stronger than the wildtype M.HgiBI. Thie result shows that R.HgiBI S176N is a stronger endonuclease than the wildtype. It hasn t gained any additional specificity.