Developmental studies for therapeutic approaches using endothelial cells derived from mouse embryonic stem cells

Abstract

The lungs together with the heart are the core of the human body. These organs maintain the homeostasis and provide substantial elements for proper functioning of the organism. Any kind of damage or dysfunction to these organs, results in serious disorders and general imbalance of the organism. Most critical are defects in the endothelial barrier, which consist of the endothelial cells (ECs). The vascular system is padded with a single layer of ECs. Endothelial cell structure and functional integrity are essential for the maintenance of the vessel wall and the circulation. Endothelial cell injury, activation or dysfunction is a feature of many pathologic states, just to mention few like inflammation or effects on vascular tone.Regenerative medicine, including cell replacement therapy, is a promising alternative for disease treatments. The application of in vitro-generated (and if required) genetically amended cells could help to recover the function of damaged parts of a specific organ. One of the approaches is to establish or restore normal function of affected endothelial cells, by therapies based on embryonic stem cells (ESCs). However, generation of those cells is ethically debatable. Development of induced pluripotent stem cells (iPS) from somatic cells has emerged as a solution. This enables the generation of patient- and disease-specific iPS cells, which may produce therapeutic cell populations without immune rejection and moral dispute. Regenerative therapies seem to carry a great promise to treat endothelial dysfunction in respiratory and cardiovascular diseases.To investigate the sites of integration of ES cell-derived endothelial (progenitor) cells, new cell lines from murine ES cells using lentiviral (LV) transduction were generated. In order to achieve the aim it had been decided to test different promoter-resistance-gene combinations. Therefore, a set of vectors containing murine promoters: VE-Cadherin (vascular endothelial) or VEGFR2 (vascular endothelial growth factor) in connection with GFP (green fluorescent protein) and antibiotic resistance genes hygromycin B, neomycin and puromycin, were produced and validated. It was feasible to generate and screen a cell line within a few weeks.The newly established cell lines are suitable for monitoring endothelial differentiation and selection by means of antibiotic resistance. These experiments demonstrated that for an effective antibiotic selection of the desired cell type, further investigations are required. It was possible to produce murine iPS cell lines, containing the above-mentioned transgenes. Carefully selected and purified murine ECs subsets will be used for in vivo studies in tumor angiogenesis models in subsequent studies. Die Lunge, zusammen mit dem Herzen, bildet den Kern des menschlichen Körpers. Gemeinsam erhalten diese Organe die Homöostase und stellen wesentliche Substanzen für die einwandfreie Funktion des Organismus zur Verfügung. Störungen oder Dysfunktionen in Teilen dieser Organe oder deren Gesamtheit führen zu schwerwiegenden Erkrankungen sowie zu einem physiologischen Ungleichgewicht. Sehr kritisch sind dabei Defekte in der endothelialen Barriere, die aus Endothelzellen aufgebaut ist. Das weit verzweigte vaskuläre System ist mit einer einzelnen Schicht dieser Endothelzellen ausgekleidet. Die Endothelzellstruktur sowie die funktionale Integrität dieser Schicht sind essentiell für die Aufrechterhaltung der Blutgefäßwand und deren zirkulatorische Funktion. Verletzungen, Aktivierungen oder Dysfunktionen der Endothelzellen sind Charakteristika verschiedener pathologischer Zustände, z.B. im Zuge von inflammatorischen Prozessen oder bei krankhaften Veränderungen des vaskulären Tonus. Die Ansätze der regenerativen Medizin, die auch eine Zellaustausch-Therapie beinhalten, sind eine vielversprechende Möglichkeit, derartige pathologische Prozesse zu behandeln. Die Verwendung in vitro-generierter und falls notwendig gentechnisch veränderter Zellen könnte zur Regenerierung der Funktion der gestörten Teile des spezifischen Organs beitragen. Die Etablierung von Therapien, basierend auf embryonalen Stammzellen könnte eine Möglichkeit sein, die normale Funktion pathologisch betroffener Endothelzellen wiederherzustellen. Jedoch befindet sich die Generierung derartiger Zellen im Spannungsfeld ethischer Diskussion.Daher ist die Entwicklung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS) aus somatischen Zellen eine Möglichkeit, diesen Debatten entgegenzutreten. Die Etablierung von iPS-Zellen ist individuell je nach Patient und Erkrankung und könnte zur Produktion von therapeutisch verwendbaren Zellpopulationen führen, die ohne Abstoßungsreaktion nutzbar sowie ethisch unbedenklich sind. Derartige regenerative Therapien sind eine vielversprechende Entwicklung zur Behandlung endothelialer Dysfunktionen in respiratorischen und kardiovaskulären Erkrankungen. Um die Funktionalität der aus Stammzellen entwickelten endothelialen (Vorläufer) Zellen zu analysieren und räumliche Verteilung zu verfolgen,wurden unter Verwendung der lentiviralen Transduktion neue Zelllinien aus Mausstammzellen mit verschiedenen Promoter/Resistenzgen-Kombinationen generiert.Die Vektoren besitzen einen spezifischen murinen Promotor, VE-Cadherin (Vaskulär-endotheliales) oder VEGFR2 (Vascular Endothelial Growth Factor Rezeptor), der die Expression von GFP (grün fluoreszierende Protein) reguliert, und ein Gen für antibiotische Resistenz, wie Hygromycin B, Neomycin oder Puromycin. Die verschiedenen hiermit generierten Zelllinien wurden etabliert und erwiesen sich als geeignet, eine Endothelzelldifferenzierung und Selektion auf Basis der spezifischen Antibiotikaresistenzen zu verfolgen. Die experimentellen Ergebnisse zeigen jedoch, dass weitere Untersuchungen notwendig sind, um eine Selektion des gewünschten Zelltyps vornehmen zu können. Die Generierung der murinen iPS Zelllinien, die die oben genannten Transgene beinhalten, befindet sich daher in einem derzeit voranschreitenden Entwicklungsprozess. Sorgfältig selektierte und aufgereinigte murine Endothelzellpopulationen sollen im weiteren Verlauf unter Inanspruchnahme eines Tumor-Angiogenese Modells in in vivo Studien eingesetzt werden.