Anpassungseffekte an ein zehnwöchiges Lauftraining unter Einfluss von PDTC (Pyrrolidindithiocarbamat) in der Maus

Abstract

Die positiven Effekte von körperlichem Training bei der Prävention verschiedenster Krankheiten sind von großer Bedeutung und Gegenstand zahlreicher Studien. Sie beruhen auf Anpassungsreaktionen des Körpers, speziell auch der Skelettmuskulatur und erfolgen auf zahlreichen Ebenen.Hierfür ist einerseits die Neusynthese und Faltung einer Vielzahl spezifischer Proteine erforderlich, andererseits auch ein kontrollierter Proteinabbau. Eine wichtige Rolle bei diesen Prozessen spielen sogenannte molekulare Chaperone sowie Proteinabbausysteme wie das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS), die durch verschiedene übergeordnete Signalwege, insbesondere den Transkriptionsfaktor nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells (NFkappaB), kontrolliert werden.Ziel dieser Arbeit war es daher, zu analysieren, zu welchen Anpassungsreaktionen ein zehnwöchiges regelmäßiges Lauftraining in der murinen Skelettmuskulatur führt. Dabei sollte ein besonderer Fokus auf metabolischen Anpassungsreaktionen, insbesondere der Fasertypspezifizierung, sowie der Regulation von Genen liegen, die für molekulare Chaperone und Komponenten des UPS kodieren. Zudem sollte der Einfluss des Transkriptionsfaktors NFkappaB auf die muskuläre Anpassung untersucht werden, indem einem Teil der Mäuse der NFkappaB-Inhibitor PDTC (Pyrrolidindithiocarbamat) verabreicht wurde. Die NFkappaB-Hemmung konnte in Skelettmuskelproben nicht direkt nachgewiesen werden, wenngleich, wie nachfolgend dargestellt, die PDTC-Behandlung zahlreiche muskuläre Anpassungsreaktionen beeinflusste. Diese sind also ggf. auf alternative Wirkmechanismen des PDTCs, z. B. seine Eigenschaften als Antioxidans und Radikalfänger, zurückzuführen.Insgesamt belegen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Anpassung der Mäuse an das Training auf verschiedenen Ebenen. Ein physiologischer Parameter in diesem Zusammenhang ist die erniedrigte Ruheherzfrequenz der Läufergruppe, die unter PDTC, aus bisher noch unklaren Gründen, sogar noch niedriger war. Auffällig war zudem ein vermindertes Gesamtgewicht der Mäuse, die ein Lauftraining unter PDTC-Behandlung absolviert hatten, im Vergleich zu allen anderen Gruppen. Dabei ließ sich allerdings nicht nachweisen, dass der detektierte Gewichtsunterschied auf eine unterschiedliche Muskelmasse zurückzuführen war. Untersuchungen zur Expression von Genen, die für fasertypspezifische langsame, oxidative oder schnelle, glykolytische Myosine kodieren, zeigten in den glykolytischen Muskeln v. a. eine Zunahme an intermediären Myosin- heavy-chain (Mhc) IIA-Fasern in den trainierten Gruppen. Im oxidativen M. soleus war ein Zuwachs dieser Fasern nur durch fasertypspezifische Färbemethoden nachzuvollziehen, bei relativer Verringerung der Mhc I- Fasern. Dies ist, wie in Antwort auf ein Ausdauertraining zu erwarten, insgesamt eher ein Signal in eine oxidative Richtung, welches im M. soleus, der bereits im Grundzustand eine deutlich oxidativere Zusammensetzung aufweist, geringer ausfiel. Auch für weitere metabolische Marker wurde eine differentielle Expression in Antwort auf das Training gefunden: Das für die Zitratsynthase, einen Marker für oxidativen Muskelstoffwechsel, kodierende Gen, war im M. gastrocnemius induziert. Tre-2/Bub2/Cdc16 domain family member 1 (Tbc1d1) hingegen spiegelt das glykolytische Potential eines Muskels wider und war im M. gastrocnemius reduziert, aber im M. soleus und im M. extensor digitorum longus induziert. Ein Effekt von PDTC war in keiner dieser Untersuchungen zu verzeichnen. Weiterhin konnte eine differentielle Expression zahlreicher Gene, die für molekulare Chaperone und andere muskelaufbauende Prozesse kodieren, in Antwort auf das Training nachgewiesen werden. Die Expression der für Calpastatin und uncoordinated mutant number 45b (Unc45b) kodierenden Gene zeigte unter Einfluss von PDTC klare Effekte, wobei diese für das Chaperon Unc45b widersprüchlich waren: Im M. extensor digitorum longus war eine Reduktion, im M. soleus eine Induktion nachzuweisen, die sich jeweils bei gleichzeitigem PDTC-Einfluss verstärkte. Auch auf Proteinebene ergab sich für den M. rectus femoris und M. triceps brachii eine Induktion bei gleichzeitiger PDTC-Behandlung. Da sich die meisten der Effekte unter PDTC deutlich verstärkten, scheint dieses einen Signaltransduktionsweg zu hemmen, der die Expression der Gene vermittelt, die für die untersuchten molekularen Chaperone kodieren. Auf der anderen Seite fanden sich nur geringe Auswirkungen des Trainings auf die für die Hitzeschockproteine heat-shock protein 90 (Hsp90), heat-shock protein 70 (Hsp70) und alpha B- Crystallin (Cryab) kodierenden Gene.Eine weitere Frage galt der Beteiligung von Abbauprozessen, insbesondere dem UPS bei Anpassungsreaktionen an Ausdauertraining. Es konnte eine Induktion von Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (Traf6), Forkhead box class O (Foxo1), neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4 (Nedd4), Ubiquitin fusion degradation protein 2 (Ufd2) und Calpain1 in Antwort auf das Training nachgewiesen werden, wobei die Ausprägung der Veränderungen abhängig von dem jeweils untersuchten Muskeltyp war. Die stress-induced phosphoprotein 1 homology and U-box containing protein 1 (Stub1)- Konzentration war dagegen vermindert.Zusammenfassend konnte somit eine differentielle Expression zahlreicher Gene, die für metabolische Faktoren, Komponenten proteinabbauender Systeme und molekulare Chaperone kodieren, in Antwort auf das Training gezeigt werden. Die Effekte waren allerdings in vielen Fällen sehr stark von der Natur des jeweils betrachteten Muskels abhängig, ein Aspekt, dem in zukünftigen Studien zur Trainingsanpassung der Skelettmuskulatur deutlich mehr Beachtung geschenkt werden sollte. The positive effects of endurance exercise are of great importance in the prevention of various diseases and subject to numerous studies. They are based on specific adaptation reactions of the body, particularly of skeletal muscle, and occur at various levels. On the one hand, this requires the de novo synthesis and folding of a multitude of specific proteins, on the other hand, controlled protein degradation is a central factor. In this context, so called molecular chaperones and also protein degradation systems like the ubiquitin-proteasome-system (UPS) play a crucial role. They are controlled by various upstream signaling pathways, particularly the transcription factor nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells NFkappaB.The purpose of this study was the analysis of the characteristics of adaptation to a ten-week treadmill experiment in murine skeletal muscle. Of specific interest were mechanisms of metabolic adaptation, particularly of fiber type specification, and the regulation of genes that encode molecular chaperones and members of the UPS. Furthermore, a potential role of the transcription factor NFkappaB was analyzed by treating one experimental group with the NFkappaB inhibitor Pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC). Despite the fact that blockade of NFkappaB activity in skeletal muscle could not be proven directly, numerous effects of PDTC treatment on various aspects of skeletal muscle adaptation were observed. This is most likely the result of other modes of action of PDTC, e. g. its nature as an antioxidant and radical catcher.Altogether the results of this study give evidence of an adaptation process at diverse levels. A physiological signal in this context is the reduction of the resting heart rate in exercising mice, which, for unknown reasons, was even more pronounced under PDTC treatment. In addition, a remarkable finding was the reduced total body weight of mice that exercised in parallel to PDTC treatment in comparison to all other groups. Nevertheless, since there was no weight difference with regard to individual muscles, it is unlikely that this weight difference is the result of differences in total muscle mass. Analysis of expression of genes encoding for fiber type-specific slow, oxidative and fast, glycolytic myosins revealed an increase of intermediate Myosin- heavy-chain (Mhc) IIA-fibers in glycolytic muscles in the trained group. By contrast the oxidative soleus muscle showed an increase in these fibers only when the method of fiber-specific staining was applied for analysis, accompanied by a relative reduction in Mhc I-fibers. Altogether, this is rather an oxidative trend, as had to be expected in response to endurance exercise. The diverging result obtained in the soleus muscle, might be due to the basically more oxidative composition of this muscle.Genes encoding other metabolic markers also showed differential expression in response to exercise: the gene encoding citrate synthase, a marker for oxidative muscle metabolism, was induced in M. gastrocnemius. By contrast, the Tre-2/Bub2/Cdc16 domain family member 1 (Tbc1d1) gene, a marker for glycolytic potential of a muscle showed reduced expression in M.gastrocnemius, but was induced the soleus muscle and the extensor digitorum longus muscle. PDTC, by contrast, had no effect in this context.Furthermore we could detect differential expression of numerous genes encoding molecular chaperones and other regulators of enhanced muscle formation in response to exercise. The expression of the genes encoding calpastatin and unc45b showed a clear response to PDTC treatment, whereupon effects differed in case of uncoordinated mutant number 45 (unc45b): there was a reduction in the extensor digitorum longus muscle and an induction in the soleus muscle with exercise, both more distinct under PDTC treatment. In the rectus femoris muscle and the triceps brachii muscle, there was also an induction at the protein level under PDTC treatment. Most of the effects were enhanced with PDTC, thus, this compound seems to block a signaling pathway which mediates expression of genes encoding a set of molecular chaperones. On the other hand, there was only little effect of exercise on heat-shock protein 90 (Hsp90), heat-shock protein 70 (Hsp70) and alpha B-crystallin (Cryab) genes.Another aim of the study was to reveal the involvement of degradation, specifically the UPS, in adaptation to endurance exercise. Remarkably, there was an induction of Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (Traf6), Forkhead box class O (Foxo1), neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4 (Nedd4), Ubiquitin fusion degradation protein 2 (Ufd2) and Calpain1 in response to exercise, however the effects differed depending on the examined muscle type. By contrast, the concentration of stress-induced phosphoprotein 1 homology and U-box containing protein 1 (Stub1) was reduced.In summary, differential expression of numerous genes encoding metabolic regulators, components of protein degradation systems and molecular chaperones could be shown in response to exercise. Frequently, the results varied depending on the nature of the examined muscle. Consequently, future studies on skeletal muscle adaptation to exercise should pay more attention to this issue.