Genetische Unterschiede zwischen Coxiella burnetii-Isolaten und ihre Korrelation zur Epidemiologie und Klinik des Q-Fiebers

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden auf chromosomaler und extrachromosomaler Ebene verschiedene C. burnetii-Isolate genetisch charakterisiert. Das Ziel war es, eine Verbindung zwischen dem jeweiligen Coxiella-Genotyp und der Verlaufsform des Q-Fiebers herzustellen.Die Entwicklung einer plasmidspezifischen Multiplex-PCR erlaubte die Diskriminierung zwischen Isolaten mit dem QpH1-, QpRS- und QpDV-Plasmid und Isolaten mit chromosomal integrierten Plasmidsequenzen. Das Vorhandensein des QpH1-Plasmids konnte bei der Mehrheit der analy¬sierten Isolate bestätigt werden. Ein unerwarteter Befund, nämlich das Vorkommen von vermeintlich QpRS-Plasmid-spezifischen Sequenzen bei Isolaten mit dem QpDV-Plasmid wurde durch die Etablierung einer XL-PCR, sowie anderer konventioneller PCRs überprüft. Als Ergebnis zeigte sich, dass zwei von drei QpRS-Plasmid-spezifischen Seg¬menten auch bei Isolaten mit dem QpDV-Plasmid vorkamen. Diese beiden Sequenzabschnitte fehlten in der veröffentlichen Sequenz des QpDV-Plamids und wurden vermutlich durch einen Sequenzierfehler nicht erkannt. Die neuen Informationen zum QpDV-Plasmid konnten genutzt werden um eine QpDV-spezifische PCR zu etablieren.Das acute disease antigen A- (adaA-) Gen von C. burnetii galt bisher als Virulenzmerkmal und wurde nur bei Isolaten nachgewiesen, die akutes Q-Fieber beim Menschen verursachten, während C. burnetii-Isolate von Patienten mit chronischem Q-Fieber dagegen adaA-negativ waren. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass drei Coxiella-Stämme, welche von Menschen mit akuten Verlaufsformen stammten, keine adaA-Sequenz enthielten. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass die Präsenz des adaA-Gens und die Verlaufsform des Q-Fiebers beim Menschen (akut oder chronisch) nicht miteinander korrelieren. Da in der Literatur auch adaA-positive C. burnetii-Isolate beschrieben wurden, die das QpDV-Plasmid enthalten, scheint die gefundene Korrelation zwischen dem adaA-Gen und dem QpH1-Plasmid, welche immer gleichzeitig im Genom vorhanden waren, nicht generell zu gelten.Mittels PFGE wurden nach Not I-Verdau der genomischen DNA von 30 C. burnetii-Isolaten, zusätzlich zu den 20 schon vorher in der Literatur be¬schriebenen Restriktionsgruppen, drei neue genomische Gruppen identifiziert. Die Anzahl der zuvor beschriebenen Gruppen konnte außerdem durch den Nachweis, dass ein von Jäger et al. (1998) verwendeter Referenzstamm falsch der Gruppe VI zugeordnet wurde, auf 21 erhöht werden. Somit gibt es nun bei C. burnetii insgesamt 24 Restriktionsgruppen. Die meisten Restriktions¬gruppen enthielten Isolate aus einer bestimmten geographischen Her¬kunft, während nur ein geringerer Teil der Isolate eine weltweite Verbreitung aufwies.Die MLVA-Technik mit nur sieben untersuchten polymorphen VNTRs erwies sich als die beste Methode für eine schnelle und präzise Charakterisierung des C. burnetii-Genoms. 101 der 103 untersuchten C. burnetii-Isolate wurden in vier große genomische Gruppen mit insgesamt 41 Genotypen eingeteilt. Wie bei der PFGE, waren manche der Genotypen nur in einem Gebiet vorhanden, während andere in mehreren Kontinenten nachgewiesen werden konnten. Bisher gibt es für die Untersuchung von C. burnetii-Isolaten mittels MLVA noch keine standardisierte Methode, wie sie bereits für andere Bakterienspezies beschrieben und auch in einer MLVA-Datenbank (http://www.mlva.eu/) veröffentlicht ist. Deshalb wäre es dringend erforderlich eine solche Standardisierung der MLVA-Methode für C. burnetii vorzunehmen und alle identifizierten Genotypen in einer Datenbank niederzulegen. Dies würde einen schnellen und weltweiten Zugriff auf diese Daten ermöglichen und auch zur effektiven Beantwortung epidemiologischer Fragestellungen beitragen.Alle im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten geneti¬schen Analysen bestätigen die Annahme, dass die Plasmid-Ausstattung eine direkte Korrelation zu den genomischen Eigenschaften der Coxiellen aufweist, was bedeutet, dass die Präsenz eines bestimmten Plasmidtyps mit dem Vorhandensein definierter Chromosomen einhergeht. Es konnten jedoch keine direkten Beziehungen zwischen Genom und Krankheitsverlauf festgestellt werden, was die An¬nahme einer Interaktion zwischen Wirt und Erreger als Hauptursache für den Krank¬heitsverlauf beim Menschen verstärkt. In the present study basic research on the genetic characterization of C. burnetii isolates with respect to their chromosomes and plasmids was conducted with the aim to establish a connection between genetic endowment and epidemiological properties of coxiellae. A plasmid specific multiplex PCR was developed to differentiate between isolates carrying QpH1, QpRS, and QpDV plasmids and plasmid sequences integrated into the chromosome. As was expected most of the C. burnetii isolates carried the QpH1 plasmid. To clarify a rather unexpected result, namely the presence of QpRS specific sequences in QpDV bearing coxiellae, a XL PCR as well as several conventional PCRs were established. As a result two out of three QpRS specific sequences were shown to be also present in QpDV plamids. These two segments are missing in the published sequence of the QpDV plasmid and were most obviously the result of a sequencing error. This new information was used to establish a QpDV specific PCR.So far the acute disease antigen A (adaA) gene was considered as a virulence factor and was only detected in isolates inducing acute Q fever manifestation in humans. Chronic C. burnetii isolates were shown to be adaA negative. However, in this study three of the investigated strains causing acute disease in humans did not contain the adaA sequence. These results suggest that the presence of the adaA gene and the kind of disease in humans (acute or chronic) do not correlate. Even the correlation between adaA gene and the QpH1 plasmid which always grouped together in this study, has to be revised. In literature adaA positive C. burnetii isolates are described harboring the QpDV plasmid.PFGE of NotI restricted genomic DNA of 30 C. burnetii strains revealed three new restriction groups in addition to the 20 groups already described in literature. Furthermore, the number of the previously described restriction groups could be increased to 21 due to the finding that a reference strain of restriction group VI used by Jäger et al. (1998) did not correspond with that. Therefore the number of restriction groups for C. burnetii could be extended to 24. Most of the restriction groups contained strains from a delimited geographic area, only a few demonstrated a worldwide distribution.The MLVA technique with only seven polymorphic VNTRs was found to be the best method for a fast and accurate characterization of the genome of C. burnetii. One hundred and one of 104 analyzed strains were classified in 4 genomic groups with a total of 41 genotypes. As with PFGE, some genotypes were locally delimited whereas others could be detected in several continents. Currently there is no standardized MLVA protocol for C. burnetii as is the case for other bacteria whose MLVA patterns are published in a database (http://www.mlva.eu/). Therefore it is essential to standardize the MLVA method for C. burnetii to deposit all identified genotypes in that database. This would allow a fast and worldwide access of data and contribute to the effective answering of epidemiological questions. Taken together, genetic characterization of C. burnetii isolates performed in this study confirms a direct correlation between plasmid type and chromosomal properties. This means, that a certain plasmid type is accompanied by the presence of a defined chromosome. However, no direct relations between genome and clinic form were observed. These findings further strengthen the suggestion that interaction between host and pathogen is the main factor for course of disease in humans.