Enzym- und immunhistochemische Analysen des zellulären Knochenmetabolismus eines osteoporotischen Schafmodells

Abstract

Osteoporose ist eine systemische Skeletterkrankung mit erhöhter Frakturanfälligkeit aufgrund eines Knochenmasseverlustes sowie einer Verschlechterung der Mikroar- chitektur des Knochens. Die Prävalenz der Osteoporose bei über 50-Jährigen liegt für Frauen in etwa bei 24% und für Männer bei 6%, steigt jedoch mit zunehmendem Alter weiter an. Das Lebenszeitrisiko eine mit Osteoporose assoziierte Fraktur zu erleiden beträgt für Frauen bis 50% und für Männer bis 22%. Diese Frakturen stellen nicht nur eine enorme Belastung für das Gesundheitswesen dar, sondern gehen häufig mit Komplikationen in der operativen Versorgung sowie der Knochenheilung einher und haben weitreichende Folgen für die Patienten. Ätiologisch resultieren alle Formen der Osteoporose aus einer Entkopplung von Knochenaufbau und -abbau während des Remodelingprozesses und führen so zu einer verminderten Knochenstärke.Diese experimentelle Studie diente der Etablierung eines osteoporotischen Großtier- modells, um nachfolgend neue Materialien und Implantate im erkrankten Knochen unter menschenähnlichen Bedingungen testen zu können. Dazu wurden 31 weibliche Merinolandschafe in vier Gruppen aufgeteilt und erfuhren folgende Behandlungen: 1) unbehandelte Kontrolle, 2) bilaterale Ovariektomie (OVX), 3) OVX und kalzium- sowie Vitamin-D-arme Diät (OVX+D) und 4) OVX, Diät und Steroidinjektionen (OVX+D+S). Nach acht Monaten wurden die Tiere euthanasiert und Femur sowie LWK4 entnom- men. Die deskriptive sowie histomorphometrische Analyse des trabekulären Knochens erfolgte mithilfe der Toluidinblau sowie der Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung. Die alka- lische Phosphatase (ALP) Färbung diente zur Bestimmung von Menge und Aktivität der Osteoblasten. Mithilfe der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP) Färbung wurde Menge und Aktivität der Osteoklasten ermittelt. Zur Evaluierung der Osteoklas- togenese wurde RANK-L und OPG immunhistochemisch angefärbt. Die Minera- lisierungsrate konnte durch in vivo injizierte Fluoreszenz-Marker bestimmt werden.OVX zeigte keine Veränderungen der Trabekelparameter aber eine leichte Erhöhung des Knochenkatabolismus. In OVX+D war die Heterogenität sehr groß, jedoch konnten keine wesentlichen Einflüsse auf Knochen oder Metabolismus ausgemacht werden. Erst die zusätzliche Steroidgabe führte zu einem Knochenmasseverlust, wobei der re- duzierte Knochenkatabolismus auf die Entstehung einer Glucocorticoid-induzierten Os- teoporose (GIO) hindeutete. Der erhöhte Knochenanabolismus sowie eine ebenfalls vorliegende Mineralisierungsstörung verdeutlichten, dass sich gleichzeitig eine Osteo- malazie entwickelte. Zusammen mit neuen Studien, die eine wesentlich größere Häu- figkeit der Osteomalazie beweisen als bislang angenommen, zeigt die vorliegende Ar- beit, dass die Dreifachbehandlung (OVX+D+S) von Schafen ein geeignetes Osteo- porosemodell darstellt und somit auch für zukünftige Versuche am erkrankten Knochen relevant ist. Diese Arbeit demonstriert zudem die außerordentliche Rolle, welche Os- teozyten bei der Regulierung des Knochenmetabolismus spielen. Osteoporosis is a systemic skeletal disorder with increased fracture risk due to loss of bone mass and microarchitectural deterioration of bone tissue. The prevalence of os- teoporosis in people prior to 50 years of age is about 24% for women and 6% for men and continues to raise with increasing age. The lifetime risk to sustain an osteoporosis- associated fracture is up to 50% for women and 22% for men. These fractures consti- tute not only an enormous burden for the health care system, but also involve compli- cations in the surgical treatment as well as bone healing defects and thus have exten- sive consequences for patients. All forms of osteoporosis causally result from an un- coupling of bone resorption and bone formation during the remodeling process, which leads to a lower bone strength with higher fracture risk.The aim of this study was to establish a large animal model for osteoporosis to subse- quently test new bone graft materials and implants in diseased bone under human-like conditions. Therefor 31 female merino sheep were divided in four groups and treated with: 1) untreated control, 2) bilateral ovariectomy (OVX), 3) OVX plus calcium and vit- amin D deficient diet (OVX+D) and 4) OVX, diet plus steroid injections (OVX+D+S). After eight months of treatment the animals were euthanized and femur and spine samples were collected. A descriptive as well as a histomorphometric analysis was per- formed in Toluidine blue and in Hematoxylin-Eosin (HE) staining. The alkaline phos- phatase (ALP) staining was used to determine the amount and activity of osteoblasts. Whereas the determination of the amount and activity of osteoclasts was done by the Tartrat-resistent acid phosphatase (TRAP) staining. To evaluate the osteoclastogenesis an immunhistochemical staining of RANK-L and OPG was performed. The mineral ap- position rate was calculated by use of in vivo fluorescent labeling.OVX showed a light increase in bone catabolism but no changes in trabecular parame- ters. OVX+D was very heterogeneous but there were no crucial influences on the bone metabolism. Only the additional steroid administration resulted in a significant loss of bone mass and microarchitectural changes. The reduced bone catabolism indicates, that steroids cause a glucocorticoid-induced osteoporosis (GIO). Whereas the bone anabolism was enhanced and the mineralization was impaired, which together illus- trates the simultaneous development of osteomalacia. New surveys show, that osteo- malacia is more common than thought. Together with the results from the present study this indicates, that the tripple treatment (OVX+D+S) of sheep is an appropriate model for osteoporosis and is therefor relevant for future experiments on diseased bone. This work also demonstrates the outstanding role of osteocytes in regulation of bone me- tabolism.