Untersuchungen zur posttranslationalen Modifikation von Voltage-Dependent Anion Channels (VDACs) in bovinen Spermatozoen
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Zusammenfassung
Voltage-dependent anion channels (VDACs) sind 30-36 kDa große, porenformende Proteine, die in der äußeren mitochondrialen Membran und in der Plasmamembran von Eukaryoten vorkommen. In vorangegangenen Studien konnten VDAC2 und VDAC3 Proteine in den outer dense fibers, (ODF, Mantelfasern) boviner, ejakulierter Spermatozoen lokalisiert werden. Im bovinen Hoden wurde VDAC1 in Sertolizellen und VDAC2 in Spermatozyten, Spermatiden und Spermatozoen nachgewiesen. Über das Vorkommen von VDAC3 in bovinen Hoden ist bisher nichts bekannt. Aus der Literatur kann aufgrund von Analogien zu somatischen Zellen die Hypothese aufgestellt werden, dass VDACs in Spermatozoen durch Phosphorylierung an Tyrosin- und Threoninresten posttranslational modifiziert werden.Ziel der Dissertationsarbeit war es, erstmals Informationen über die Lokalisation und posttranslationale Modifikation von VDAC Isoformen in bovinen Spermatozoen zu erhalten; mögliche Veränderungen einer Tyrosin- und/oder Threoninphosphorylierung der VDAC Subtypen während der Spermatozoenreifung sollten untersucht werden. Dazu wurden VDAC Proteine aus bovinen Spermatozoen der verschiedenen Nebenhodenabschnitte und aus Ejakulaten extrahiert und mit biochemischen und immunbiochemischen Methoden identifiziert. Durch den Einsatz von Subtyp-spezifischen anti-VDAC Antikörpern konnten VDAC2 und VDAC3 in Gesamtproteinextrakten aus Caput epididymidis, Corpus epididymidis, Cauda epididymidis sowie aus Ejakulaten nachgewiesen werden. Aus den Gesamtproteinextrakten erfolgte eine Proteinreinigung mittels Säulenchromatografie. Immunoblots mit anti-VDAC Antikörpern und MALDI-TOF-MS Analysen bestätigten, dass es sich bei den gereinigten Proteinen um VDAC2 und VDAC3 handelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals, dass VDAC2 und VDAC3 Proteine aus bovinen Spermatozoen mit biochemischen Methoden isoliert werden können. Mit Hilfe der Immunzytochemie gelang es, in epididymalen und ejakulierten Spermatozoen VDAC2 hauptsächlich im Mittelstück und VDAC3 vor allem im Hauptstück des Flagellums zu lokalisieren. Somit wurden die VDAC Subtypen 2 und 3 in unterschiedlichen Kompartimenten der bovinen Samenzelle nachgewiesen. Immunoblots mit anti-Phosphotyrosin und anti- Phosphothreonin Antikörpern ergaben, dass VDAC2 und VDAC3 Proteine, die aus epididymalen und ejakulierten Spermatozoen angereichert wurden, an Tyrosin- und an Threoninresten phosphoryliert sind. Aus den Untersuchungen ergeben sich erste Hinweise darauf, dass VDAC Funktionen in Spermatozoen durch Phosphorylierung reguliert werden könnten. Da VDACs permeabel für ATP und Ca2+ sind, wäre es denkbar, dass in Spermatozoen VDAC Isoformen an der Speicherung und Bereitstellung von ATP und Ca2+ beteiligt sind. Die Freisetzung dieser Moleküle könnte durch die Phosphorylierung von VDAC reguliert werden. Die Ergebnisse dieser Dissertation bieten eine Grundlage für weitere Untersuchungen zur Überprüfung der Frage, ob VDAC Proteine und deren Phosphorylierungsstatus an der Regulation der Spermatozoenmotilität beteiligt sind.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
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Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : http://www.dvg.net/ DVG Service, 2007