Untersuchungen zur posttranslationalen Modifikation von Voltage-Dependent Anion Channels (VDACs) in bovinen Spermatozoen

Abstract

Voltage-dependent anion channels (VDACs) sind 30-36 kDa große, porenformende Proteine, die in der äußeren mitochondrialen Membran und in der Plasmamembran von Eukaryoten vorkommen. In vorangegangenen Studien konnten VDAC2 und VDAC3 Proteine in den outer dense fibers, (ODF, Mantelfasern) boviner, ejakulierter Spermatozoen lokalisiert werden. Im bovinen Hoden wurde VDAC1 in Sertolizellen und VDAC2 in Spermatozyten, Spermatiden und Spermatozoen nachgewiesen. Über das Vorkommen von VDAC3 in bovinen Hoden ist bisher nichts bekannt. Aus der Literatur kann aufgrund von Analogien zu somatischen Zellen die Hypothese aufgestellt werden, dass VDACs in Spermatozoen durch Phosphorylierung an Tyrosin- und Threoninresten posttranslational modifiziert werden.Ziel der Dissertationsarbeit war es, erstmals Informationen über die Lokalisation und posttranslationale Modifikation von VDAC Isoformen in bovinen Spermatozoen zu erhalten; mögliche Veränderungen einer Tyrosin- und/oder Threoninphosphorylierung der VDAC Subtypen während der Spermatozoenreifung sollten untersucht werden. Dazu wurden VDAC Proteine aus bovinen Spermatozoen der verschiedenen Nebenhodenabschnitte und aus Ejakulaten extrahiert und mit biochemischen und immunbiochemischen Methoden identifiziert. Durch den Einsatz von Subtyp-spezifischen anti-VDAC Antikörpern konnten VDAC2 und VDAC3 in Gesamtproteinextrakten aus Caput epididymidis, Corpus epididymidis, Cauda epididymidis sowie aus Ejakulaten nachgewiesen werden. Aus den Gesamtproteinextrakten erfolgte eine Proteinreinigung mittels Säulenchromatografie. Immunoblots mit anti-VDAC Antikörpern und MALDI-TOF-MS Analysen bestätigten, dass es sich bei den gereinigten Proteinen um VDAC2 und VDAC3 handelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals, dass VDAC2 und VDAC3 Proteine aus bovinen Spermatozoen mit biochemischen Methoden isoliert werden können. Mit Hilfe der Immunzytochemie gelang es, in epididymalen und ejakulierten Spermatozoen VDAC2 hauptsächlich im Mittelstück und VDAC3 vor allem im Hauptstück des Flagellums zu lokalisieren. Somit wurden die VDAC Subtypen 2 und 3 in unterschiedlichen Kompartimenten der bovinen Samenzelle nachgewiesen. Immunoblots mit anti-Phosphotyrosin und anti- Phosphothreonin Antikörpern ergaben, dass VDAC2 und VDAC3 Proteine, die aus epididymalen und ejakulierten Spermatozoen angereichert wurden, an Tyrosin- und an Threoninresten phosphoryliert sind. Aus den Untersuchungen ergeben sich erste Hinweise darauf, dass VDAC Funktionen in Spermatozoen durch Phosphorylierung reguliert werden könnten. Da VDACs permeabel für ATP und Ca2+ sind, wäre es denkbar, dass in Spermatozoen VDAC Isoformen an der Speicherung und Bereitstellung von ATP und Ca2+ beteiligt sind. Die Freisetzung dieser Moleküle könnte durch die Phosphorylierung von VDAC reguliert werden. Die Ergebnisse dieser Dissertation bieten eine Grundlage für weitere Untersuchungen zur Überprüfung der Frage, ob VDAC Proteine und deren Phosphorylierungsstatus an der Regulation der Spermatozoenmotilität beteiligt sind.

Voltage-dependent anion channels (VDACs) are small pore-forming proteins identified in outer mitochondrial membranes and in the plasma membrane of eukaryotes. In previous studies, VDAC2 and VDAC3 proteins could be identified in the outer dense fibers (ODF) of ejaculated bovine sperm. VDAC1 was found in Sertoli cells and VDAC2 was present in spermatocytes, spermatids and spermatozoa of the bovine testis. Data published in literature led to the hypothesis that, in analogy to somatic cells, posttranslational modification of VDACs (e.g. phosphorylation of tyrosine- or threonine residues) in spermatozoa could possibly be involved in the regulation of sperm function. The aim of this study was to gain more information about the localisation and regulation of VDACs in bovine spermatozoa, particularly to analyse tyrosine and threonine phosphorylation of VDAC proteins during sperm cell maturation. Using subtype-specific anti-VDAC antibodies, VDAC2 and VDAC3 could be detected in protein extracts of spermatozoa isolated from caput epididymidis, corpus epidiymidis, cauda epididymidis as well as in ejaculated sperm cells. From the total protein extract, proteins were purified using biochemical methods. Immunoblot analysis and MALDI-TOF-MS revealed that the purified proteins were VDAC2 and VDAC3. To our knowledge, this is the first report on the purification of VDAC2 and 3 from bovine spermatozoa. Immunocytochemistry with epididymal and ejaculated sperm revealed that VDAC3 is abundant in the principal piece while VDAC2 was found mainly in the midpiece of the flagellum. Thus VDAC2 and 3 subtypes are located in different sperm compartments; this finding and data from literature suggest that bovine VDAC are located in ODF and/or the fibrous sheath. Using anti-phosphotyrosine and anti-phosphothreonine specific antibodies, western blot analysis showed that purified VDAC2 and 3 proteins from epididymal and ejaculated spermatozoa were phosphorylated at threonine residues and at tyrosine residues. Thus, the hypothesis is strengthened that VDAC function in spermatozoa is regulated by tyrosine and threonine phosphorylation. Because VDACs are permeable for ATP and Ca2+, VDAC proteins could play also a role for storage and supply of ATP and Ca2+ in the sperm flagellum; the release of ATP and Ca2+ could be regulated by VDAC phosphorylation. Therefore, the results presented in this thesis could be the basis for further investigations to answer the question whether sperm motility is affected by VDAC proteins and their status of phosphorylation.