Charakterisierung der Schilddrüsenfunktion und Nachweis eines Promotordefektes als Ursache des kompletten Thyroxin-bindenden Globulinmangels beim Hund

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Schilddrüsenfunktion des Hundes charakterisiert und erstmals die Ursache für das Fehlen von Thyroxin-bindendem Globulin (TBG) beim Hund mit molekularbiologischen Methoden nachgewiesen. In einer retrospektiven Analyse wurde gezeigt, dass das Verhältnis der freien zu totalen Thyroxinspiegel in Hundeseren mit 1:1200 deutlich höher lag als in menschlichen Seren mit 1:6400. Als Erklärung für die geringere Schilddrüsenhormonbindungskapazität beim Hund wurde mittels eines spezifischen T4-Bindungstests nachgewiesen, dass der Hund kein TBG exprimiert. Bei der Untersuchung des TBG-Gens vom Hund fanden sich keine offensichtlichen, die Synthese oder die Sekretion beeinträchtigenden Mutationen oder Frameshifts in der cDNA oder in der Aminosäuresequenz des Hunde-TBG. Allerdings fand sich im mitsequenzierten Promotorbereich, 68 Basenpaare vor der Transkriptionsstartstelle im Vergleich zur Sequenz des menschlichen TBG-Promotors eine Substitution von drei Basenpaaren TTA à GAG in der Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors HNF-1 (hepatocyte nuclear factor-1). Im Luciferaseassay konnte gezeigt werden, dass die drei Nukleotidsubstitutionen beim Hund keine nennenswerte Promotoraktivierung zulassen. Im Vergleich dazu zeigte die Mäuse-TBG-Promotor Sequenz, die nur eine Mutation in der HNF-1 Bindungsstelle hat, eine genauso gute Aktivierung des TBG-Promotors wie die HNF-1 Bindungsstelle vom Menschen. Als Ursache des Fehlens von TBG beim Hund konnte somit ein Defekt in der HNF-1 Bindungsstelle im Promotor des TBG Gens nachgewiesen werden. Nebenbefundlich konnte das TBG des Hundes, obwohl es nicht exprimiert wird, anhand seiner cDNA- und Aminosäuresequenz in den Stammbaum der Säugetier-TBGs aufgenommen werden.

In the present dissertation the dog thyroid function was characterized and, for the first time, the reason for total thyroxin-binding globulin (TBG) deficiency in dogs was determined by molecular methods. In a retrospect analysis of dog sera, their free to total thyroxin (T4) ratio was found to be much higher (1:1200) than in human sera (1:6400). With a specific T4-binding assay, complete TBG-deficiency was found to be the cause of lower thyroxine binding capacity in dogs. Sequencing of the dog TBG gene revealed no obvious mutations or frameshifts in the cDNA or amino acid sequence to explain the complete TBG deficiency. However, compared to the human TBG-promoter, a three base pair substitution TTAàGAG was found in the hepatocyte nuclear factor-1 binding site (HNF-1) 68 base pairs 5´ of the transcription start site. Expression of promoter constructs in a luciferase assay verified that the three nucleotide substitution in the dog HNF-1 binding site completely abolished transcription. In comparison, the mouse TBG promoter, which contains a HNF-1 binding site with only one mutation, had the same transcriptional activity as the human HNF-1 binding site. Thus, a defect in the dog HNF-1 binding site in the canine TBG promoter was found to cause this complete TBG deficiency. In addition, canine TBG, although not expressed, could be incorporated into the phylogenetic tree of mammalian TBGs.