Mutationsanalyse des PCDH19-Gens bei frühkindlichen epileptischen Enzephalopathien

Abstract

Diese Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Bedeutung des PCDH19-Gens und dem dazugehörigen klinischen Bild bei weiblichen Patienten mit frühkindlicher myoklonischer Epilepsie. Für die Untersuchung des PCDH19-Gens auf Mutationen wurden die Blutproben eines Kollektivs von 108 Patienten mit Dravet-Syndrom-ähnlicher Symptomatik, die zuvor negativ auf Mutationen innerhalb des SCN1A-Gens getestet wurden, analysiert. Zu diesem Zweck wurden alle sechs Exons inklusive der angrenzenden intronischen Sequenzen des auf dem X-Chromosom lokalisierten PCDH19-Gens amplifiziert und sequenziert. Zusätzlich erfolgte eine Untersuchung mittels des SSCP-Verfahrens (single strand conformation polymorphism). Insgesamt konnten elf Mutationen (11/108=10,2%) nachgewiesen werden, die sich aus vier Missense Mutationen, vier Deletionen, einer Duplikation und zwei kombinierten Deletionen mit Insertionen zusammensetzen. Zusätzlich wurden drei stille Mutationen entdeckt, die nicht als Polymorphismen bekannt sind. Bei etwa 57% der DNA-Proben konnten insgesamt fünf verschiedene Polymorphismen reproduziert werden, die bereits im Reference SNP Cluster Report verzeichnet sind.Zehn der elf Mutationen bewirken eine Veränderung der Aminosäurensequenz der extrazellulären Domäne des vom PCDH19-Gen codierten Protocadherins, während die elfte Mutation zu einer Variation der innerhalb der Zelle gelegenen Domäne des Protocadherins führt. Mit Hilfe des SSCP-Verfahrens konnten die Deletionen, Insertionen und Duplikationen in etwa 92% (55 von 60) aller Fälle nachgewiesen werden, wenn man das Verfahren mit und ohne Glycerin-Färbung zusammen betrachtet sogar in 100% (30 von 30). Bei den zwei Missense Mutationen konnte in 56,5% (13 von 23) der Ansätze die Mutation identifiziert werden, zählt man die Technik mit und ohne Glycerin-Färbung zusammen, kommt man auf ein Ergebnis von 75% (9 von 12). Die Polymorphismen konnten insgesamt in 30% (39 von 130) dargestellt werden, wobei allerdings einige (13/130=10%) davon nur unzureichend identifizierbar waren. Insgesamt stellt die SSCP-Methode somit ein Verfahren dar, welches sich hervorragend als Screeningmethode für Mutationen mit Leserasterverschiebung eignet, jedoch bei Punktmutationen nur eingeschränkt anwendbar ist.Die klinischen Merkmale der Probanden mit einer PCDH19-Mutation zeigten sich in einem Durchschnittsalter bei Erstanfall von 12 Monaten (Median: 9 Monate), dabei handelte es sich bei 5 von 10 (50%) Patienten um febrile Anfälle. Die Anfallstypen äußerten sich dabei hauptsächlich tonisch-klonisch generalisiert (8/11), einfach fokal (2/11), fokal mit sekundärer Generalisierung (3/11), atonisch generalisiert (1/11) und klinisch als Absence mit Tonuserhöhung (1/11). Acht von neun Probanden sind in ihrer Entwicklung leicht bis moderat verzögert, nur bei einer von neun Probandinnen wurde von einer durchschnittlichen Intelligenz berichtet. Zusammenfassend konnte mit dieser Studie gezeigt werden, dass dem PCDH19-Gen im Zusammenhang mit frühkindlicher myoklonischer Epilepsie bei Mädchen eine große Bedeutung zukommt.

This thesis deals with the importance of the PCDH19 gene and the associated clinical phenotype in female patients with early childhood myoclonic epilepsy.In order to investigate the occurrence of mutations within the PCDH19 ge- ne, blood samples a cohort of 108 patients with Dravet syndrome-like symptoms, which have been previously tested negative for any mutations within the SCN1A gene, were examined. For this purpose all six exons including adjacent intronic sections of the PCDH19 gene, which is located on the X chromosome, were ampli- fied and sequenced. The SSCP method (single beach conformation polymorphism) was used for additional analysis.A total of eleven mutations (11/108 = 10.2%) were detected, which are compo- sed of four missense mutations, four deletions, one duplication and two deletions combined with insertions. In addition, three silent mutations were discovered, which have not been described as polymorphisms before. In about 57% of all DNA samples a total of five different polymorphisms could be reproduced that have already been listed in the Reference SNP Cluster Report. Ten of the eleven mutations result in a change of the amino acid sequence within the extracellular domain of the protocadherin which is encoded by the PCDH19 gene, while the eleventh mutation leads to a variation of the intercellular located domain.Using the SSCP method, approximately 92% (55 of 60) of all deletions, inser- tions and duplications could be identified. If the results obtained by experiments performed with and without glycerol staining are considered in combination, even 100% (30 of 30) could be detected. In case of the two missense mutations the SSCP method was able to detect them in 56,5% (13 of 23), in combination of both me- thods in 75% (9 of 12). The polymorphisms could be demonstrated in 30% (39 of 130), whereas some (13/130 = 10%) could not be identified in a sufficient manner. Thus, the SSCP represents a method which is suitable to screen for frameshift mutations, however, its applicability to identify point mutations is limited.The clinical characteristics of patients with a PCDH19 mutation showed in a mean age at of 12 months (median: 9 months) the primary seizure, and 5 of 10 (50%) patients had febrile seizures. The types of seizures were mainly tonic- clonic generalized (8/11), simply focally (2/11), focal with secondary generaliza- tion (3/11), atonic generalized (1/11) and clinically absence of increase in tone (1 / 11). Eight of the nine patients are slightly to moderately retarded in their development, only in case of one of nine patients an average intelligence has been reported. In summary, this study was able to show that the PCDH19 gene as- sociated with myoclonic epilepsy of early childhood in girls plays an important role.