Bioresorbable magnesium implants for bone applications

Abstract

Background. Clinical problems like postoperative infection and increased incidence of pediatric trauma requiring surgical intervention raised the need for temporary medical implants that would resorb after the bone healing is complete. This would decrease high costs associated with repeated surgeries, minimize recovery times, decrease the risk of postoperative infections, and thus promote higher quality of life to the patients. The concept of biodegradation is already known in medical practice: resorbable sutures are successfully used in surgery. However, a bone implant that would resorb after the fracture heals is a new concept. Magnesium was suggested as a suitable material for these purposes because it is biocompatible and stimulates new bone formation. This doctoral Thesis evaluates both in vitro and in vivo behaviour of magnesium-based implants and consists of four parts: degradation, cellular reaction, early biofilm formation and histology study.Materials and Methods. Degradation properties of Mg2Ag, Mg10Gd, WE43 and 99.99 % pure Mg were studied by immersion and gas evolution tests. The corrosion rate (CR), osmolality, pH, Ca2+ concentrations, and surface changes were determined. Biocompatibility was studied by exposing primary human reaming debris-derived cells (HRD) to described magnesium alloys and assesing cell viability, morphology, differentiation to osteoblasts, along with evaluation of pH changes and Ca2+ concentration induced by magnesium. Mg2Ag, Mg10Gd, WE43 and 99.99 % pure Mg were further tested for their ability to resist biofilm formation. S. epidermidis and E. faecalis were allowed to adhere to the magnesium surfaces for 2 hours (h) followed by rinsing and, for S. epidermidis, further incubation of 24, 72 and 168 h was carried out. Furthermore, an animal study was performed and consisted of histological and histomorphometrical analysis of three magnesium-based materials: magnesium-hydroxyapatite (Mg-HA), W4 (96 % magnesium, 4 % yttrium), and pure magnesium (pure Mg). Bone response to magnesium and implants resorption behaviour was studied.Results. Degradation. WE43 showed the highest CR of all materials tested 1.057 mm/year which is almost twice as high as in the other samples. The lowest mean CR was in Mg2Ag group. All alloys made pH more alkaline and decreased concentration of free Ca2¬+ in the solution. Osmolality decreased in all samples after day 7. Pure Mg had the most constant Sa and Sdr of all materials over the observation period. Cellular Reaction. The number of viable cells in presence of all magnesium samples was stable over the observation period of 21 days. The inhibition of ALP content in osteogenic differentiating HRD was caused by pure Mg at day 14 and 28. All other magnesium alloys did not affect the ALP content. Exposure of HRD to magnesium increased the amount of lysosomes and endocytotic vesicles. Early Stages of Biofilm Formation. E. faecalis were significantly more prevalent on all magnesium surfaces compared to S. epidermidis (p = 0.001). Biofilm growth of S. epidermidis was different on various magnesium materials: the amount of bacteria increased up to 72 h but interestingly a significant decrease was seen at 168 h on Mg2Ag and WE43 surfaces. For pure Mg and Mg10Gd the biofilm formation reached plateau at 72 h. No correlation was found between the surface topology and the amount of adherent bacteria. Histology. Mg-HA had the highest mean amount of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) positive cells at the implantation site of all groups. It had shown the fastest degradation rate already at 6 weeks. New bone was observed in direct contact to pure Mg and W4. The mean gas volume was highest in W4 compared to pure Mg and Mg-HA but this difference was not statistically significant. Conclusions. In vitro. Mg-Ag alloys seem to be the most promising in respect to the cellular reactions, degradation rates, the effect on the surrounding environment and the ability to withstand the biofilm growth after 72 h in vitro. In vivo. Pure Mg and W4 were the most promising material in the in vivo experiment. Mg-HA had too fast resorption probably due to the high levels of HA comprising 20 % of the material s composition. The level of HA should be reduced in future studies. Hintergrund. Die erhöhte Inzidenz von pädiatrischen Verletzungen sowie postoperativen Infektionen, die eine chirurgische Intervention erfordern, lassen die Entwicklung von temporären Implantaten zunehmend notwendig erscheinen. Es werden darunter Implantate verstanden, die nach abgeschlossener Frakturheilung vollständig resorbiert werden. Ihre Verwendung würden die hohen Operationskosten zur Implantatentfernung und das Risiko von postoperativen Infektionen reduzieren sowie die Lebensqualität der Patienten steigern. Das Konzept des biologischen Abbaus ist in der medizinischen Praxis bereits bekannt: resorbierbare Nähte werden in der Chirurgie erfolgreich eingesetzt. Ein Knochenimplantat, das sich nach der Frakturheilung auflöst, wäre jedoch ein völlig neues Konzept. Magnesium könnte für die Herstellung von bioresorbierbaren Implantaten geeignet sein, da es biologisch gut verträglich ist und die Knochenbildung stimuliert. Ziel der vorliegenden Dissertation war es sowohl in vitro als auch in vivo das Verhalten von Implantate auf Magnesium (Mg)-Basis zu untersuchen. Hierbei standen vier biologische Teilprozesse im Vordergrund: Abbau, zelluläre Reaktion, frühe Bildung von Biofilmen und die histologische Beurteilung der Verträglichkeit von Magnesiumimplantaten.Materialien und Methoden. Die Degradation von Mg2Ag, Mg10Gd, WE43 und 99,99 % reinem Mg wurde durch die Analyse der Gasentwicklung, der Korrosionsgeschwindigkeit (CR), der Osmolarität, des pHs, der Ca2+ Konzentration und der Oberflächenveränderungen bestimmt. Zur Untersuchung der in vitro Biokompatibilität wurden primäre vom humanen Bohrmehl abgeleitete mesenchymalen Stammzellen (HRD) und folgende zellbiologische Methoden verwendet: MTT-Assay, Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie zur Bestimmung der zellulären Vitalität, Calcium-Verbrauch und Gehalt an alkalischer Phosphatase (ALP) zur Beurteilung der Differenzierung der HRD zu Osteoblasten und pH-Änderungen zum Nachweis einer möglichen Induktion der Knochenbildung durch Magnesium-Ionen. Weiterhin wurde die Bildung von Biofilm durch S. epidermidis und E. faecalis auf der Oberfläche von Mg2Ag, Mg10Gd, WE43 und 99,99 % reinem Mg untersucht, wofür die Implantatoberflächen über mehrere Stunden mit den Bakterien inkubiert wurden. In vivo erfolgte eine Untersuchung von Implantaten aus Magnesium-Hydroxyapatit (Mg-HA), W4 (96 % Magnesium, 4 % Yttrium) und reinem Magnesium (reines Mg), die in ein künstlich erzeugtes Bohrloch (5,5 mm) in die laterale Femurkondyle des linken Femurs von 24 weiblichen Kaninchen eingebracht wurden. Das Resorptionsverhalten der Implantate sowie die zelluläre Reaktion des Knochens wurde nach Extraktion der Knochen nach einer postoperativen Zeit von 6 und 12 Wochen histologisch, histomorphometrisch und enzymhistochemisch untersucht. Ergebnisse. Degradation. WE43 zeigte die höchste CR aller getesteten Materialien (1,057 mm/Jahr), die damit fast doppelt so hoch war wie die der anderen Proben. Die niedrigste durchschnittliche CR wurde in der Mg2Ag-Gruppe gemessen. Bei allen Mg-Legierungen wurde ein Anstieg des pHs und eine Reduktion der freien Ca2+-Ionen nachgeweisen. Nach einer 7-tägigen Inkubationszeit sank die Osmolarität in allen Proben. Reines Mg hatte die konstanteste Oberfläche (Sa und Sdr) von allen untersuchten Materialien während des gesamten Beobachtungszeitraums. Zelluläre Reaktion. Die Zahl der lebensfähigen Zellen in Anwesenheit aller Magnesiumproben war über den Beobachtungszeitraum von 21 Tagen stabil. Die osteogene Differenzierung der HRD (ALP-Gehalt) wurde von reinem Mg gehemmt (Tag 14 und 28). Die Magnesiumlegierungen beeinflussten den ALP-Gehalt nicht. Durch die Exposition mit Magnesium wurde die Menge an Lysosomen und Endocytosevesikeln erhöht. Frühe Phase der Biofilmbildung. Bakterien des Stammes E. faecalis waren signifikant häufiger auf den Magnesiumoberflächen zu finden als S. epidermidis (p = 0,001). Die Biofilmbildung von S. epidermidis war abhängig vom verwendeten Magnesiumwerkstoff: Nach einer anfänglichen generellen Erhöhung der Bakteriendichte (72 Stunden), wurde interessanterweise eine signifikante Abnahme nach 168 Stunden auf Mg2Ag und WE43 beobachtet, während für das reine Mg und Mg10Gd die Biofilmbildung nach 72 Stunden ein Plateau erreichte. Es wurde keine Korrelation zwischen der Oberflächentopologie und der Menge der adhärierenden Bakterien gefunden. Histologie. Am Interface des Mg-HA Implantats konnte die höchste durchschnittliche Menge von Tartrat-resistenten saure Phosphatase (TRAP) positiven Zellen nachgewiesen werden. Die höchste Abbaurate wurde bereits nach 6 Wochen erzielt. Die Bildung von neuem Knochen konnte in direktem Kontakt mit reinem Mg und W4 beobachtet werden. Das durchschnittliche Gasvolumen war nach Implantation von W4 am höchsten, während reines Mg und Mg-HA eine geringere aber nicht signifikante Reduktion der Gasbildung aufwiesen.Schlussfolgerungen. In vitro. Mg-Ag-Legierungen scheinen am vielversprechendsten zu sein in Bezug auf die Zellreaktionen, Abbaurate, die Auswirkung auf die Umwelt und die Fähigkeit, dem Biofilmwachstum nach 72 Stunden in vitro zu widerstehen. In vivo. Reines Mg und W4 sind die vielversprechendsten Materialien im in vivo Experiment. Mg-HA zeigte eine zu schnell Resorption, vermutlich aufgrund des hohen HA-Gehalts (20 % der Materialzusammensetzung). Das Niveau des HA-Gehalts sollte in zukünftigen Studien reduziert werden.