Untersuchung des Einfluss von CP190-Interaktionspartnern auf die CP190- und dCTCF-vermittelte Chromatinisolation in Drosophila melanogaster

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2016

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10397

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Isolatoren sind Sequenzen der DNA, die verhindern dass DNA-Abschnitte ungehindert miteinander interagieren können. Dabei haben Isolatoren zwei Funktionen, die Enhancer-Blockade und die Barriere-Funktion. Die Barriere-Funktion verhindert das Interagieren von Chromatinabschnitten unterschiedlicher Stadien, während die Enhancer-Blockade eine Interaktion von Enhancer und Promoter unterbindet (Herold et al. 2012). Isolator-bindende Proteine (IBP) vermitteln dabei die Funktionen des Isolators, indem sie an diese binden. In Drosophila gibt es insgesamt neun IBP, von denen sieben die Unterstützung von CP190 (Centrosomal Protein 190 kDa) benötigen, um die Isolatorfunktion zu vermitteln. CP190 ist in der Lage, Brücken zwischen Isolatoren und Promotoren zu bilden (Liang et al. 2014). In dieser Arbeit wurden Interaktionspartner von CP190 untersucht, die CP190 für seine Funktion bei der Isolation benötigt. Massenspektrometriedaten, Immunpräzipitationen und ein Yeast Two Hybrid Screen zeigten, dass die Zinkfinger-assoziierte Domäne (ZAD) -Proteine, Pita, ZIPIC und cg30020, mögliche Interaktionspartner für CP190 sind (Maksimenko et al. 2015). ZAD-Proteine machen etwa 10 % aller Transkriptionsfaktoren (TF) in Dipteren aus und haben dieselben Zinkfinger-Typen, wie sie auch Zinkfingerproteinen (ZFP) vorkommen (Benson et al. 2009, Chung et al. 2007, Chung et al. 2002). Um den Einfluss von Pita, ZIPIC und cg30020 auf die Chromatinbindung zu untersuchen, wurden ChIP-Seq- und ChIP-qPCR-Experimente durchgeführt. Die ChIP-Seq-Analyse von Pita und ZIPIC zeigte dabei, im Vergleich mit ChIP-Chip-Daten von CP190, dass diese Faktoren stark mit CP190 kolokalisieren. Die anschließenden ChIP-qPCR-Experimente nach knock down von CP190 bzw. Pita oder ZIPIC, konten zeigen, dass die CP190-Bindung bedingt von ZIPIC und Pita abhängig ist. Dies deutete auf einen funktionellen Zusammenhang von CP190, Pita und ZIPIC bei der Bindung an Chromatin hin. Mit Pita und ZIPIC konnten zwei weitere Isolator-bindende Proteine zusätzlich zu den bisher bekannten IBPs in Drosophila gefunden werden, die wahrscheinlich durch ihre Bindung an bestimmte DNA-Sequenzen weiter regulatorische Funktionen bei der Isolation übernehmen (Maksimenko et al. 2015).Des Weiteren wurden alle Faktoren der SUMO-Kaskade, sowie eine SUMO-Protease, in einem RNAi-Screen in Drosophila S2-Zellen gefunden (Bohla et al. 2014). SUMOylierung ist eine Proteinmodifikation, mit vielfältigen Funktionen, deren Aufgabe bei der Isolation kontrovers diskutiert wird (Capelson and Corces 2006, Golovnin et al. 2012). Auch weitere Isolatoren, die durch CP190 gebunden werden, zeigten in einem funktionalen Reporterassay ebenfalls einen Reduktion der Isolation nach dem knock down von SUMO-Faktoren. Nach dem Nachweis der SUMOylierung von CP190 wurde eine ChIPseq-Analyse von diesem, dCTCF und FLAG-dSUMO nach vor und nach FLAG-dSUMO-Expression in S2-Zellen durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass dSUMO mit CP190 und dCTCF kolokalisiert und einen Einfluss auf die Bindung von CP190 hatte, was auch durch eine unabhängige bioinformatischen GEO-Analyse von ChIP-Seq-Daten bestätigte wurde. Die Zugänglichkeit des Chromatins wurde dabei durch die Expression von FLAG-dSUMO kaum beeinflusst, wie sich in Histon H3-ChIP und FAIRE-Assay zeigte. Dennoch war das Chromatin tendenziell etwas stärker geöffnet, sobald FLAG-His-dSUMO exprimiert wurde. Diese Resultate deuten darauf hin, dass SUMOylierung keine eindeutige Funktion bei der Isolation, bei der Bindung an Chromatin und bei der Zugänglichkeit des Chromatins einnimmt, sondern zu einer Homöostase beiträgt, indem eine dynamische SUMOylierung und De-SUMOylierung von Faktoren stattfindet, die an diesen Prozessen beteiligt sind, wie CP190 oder Polycomb-Proteinen (Gonzalez et al. 2014).

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