Untersuchung des CDK2, 7 und 9 Inhibitors SNS-032 in chemosensitiven und chemoresistenten Neuroblastomzellen

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2014

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10331

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In der vorliegenden Arbeit wurde SNS-032, ein niedermolekularer Inhibitor für die Cyclin-abhängigen Kinasen (cyclin dependent kinases, CDKs) 2, 7 und 9, erstmals im Neuroblastom auf seine antitumorale Wirkung untersucht. In dieser Arbeit wurde SNS-032 in einer Auswahl von 113 Neuroblastomzelllinien, bestehend aus 19 parentalen Zelllinien und 94 Sublinien mit einer erworbenen Resistenz gegenüber 14 verschiedenen Zytostatika, untersucht. Bei 73% der untersuchten Zelllinien und 4 weiteren primären Neuroblastomkulturen lagen die Konzentrationen von SNS-032, welche die Viabilität um 50% beeinträchtigen, im therapeutisch erreichbaren Bereich von < 754 nM. In 62% der Zelllinien und zwei primären Neuroblastomkulturen konnte die Viabilität sogar um 90% reduziert werden. Durch Kombination mit konventionellen Zytostatika konnte dieser Effekt in UKF-NB-3 und in an Melphalan, Topotecan und Cisplatin adaptierten Sublinien noch zusätzlich gesteigert werden. SNS-032 beeinträchtigte ebenfalls das Wachstum der an Cisplatin-adaptierten UKF-NB-3 Sublinie UKF-NB-3rCDDP1000 in Mäusen. Es wurde des Weiteren erstmals untersucht, inwiefern die Expression der ABC-Transporter ABCB1 und ABCG2 die Wirkung von SNS-032 beeinflusst. Durch pharmakologische Inhibierung von ABCB1 in stark ABCB1- und ABCG2-expremierenden und weiteren stark ABCB1-expremierenden chemoresistenten Sublinien konnte eine starke ABCB1-Abhängigkeit von SNS-032 nachgewiesen werden. Dies konnte durch RNAi-vermittelte Verminderung von ABCB1 in UKF-NB-3ABCB1 Zellen und nachfolgende Resensibilisierung gegenüber SNS-032 bestätigt werden. Des Weiteren konnte in UKF-NB-3 Zellen (UKF-NB-3rSNS-032300nM), welche durch Adaptierung an steigende Konzentrationen von SNS-032 etabliert wurden, die Expressionsinduktion von ABCB1 und eine dadurch bestehende Kreuzresistenz gegenüber verschiedenen ABCB1-Substraten als hauptsächlicher Resistenzmechanismus gegenüber SNS-032 nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wird die Wirkung von SNS-032 durch ABCG2 in UKF-NB-3ABCG2 Zellen zwar signifikant, jedoch in einem deutlich geringeren Maße beeinflusst. Mit Hilfe der p53-depletierten Zelllinien UKF-NB-3pcp53 und IMR-32pcp53 sowie diverser an Nutlin-3 adaptierten UKF-NB-3 und -6 Sublinien, welche Mutationen im TP53-Gen aufwiesen, konnte nachgewiesen werden, dass die Wirkung von SNS-032 in Neuroblastomzellen unabhängig von funktionellem p53 Protein ist. SNS-032 löst in Neuroblastomzellen eine intrinsisch Apoptose aus, was durch den Nachweis des Verlustes des mitochondrialen Membranpotentials, der Aktivierung von Bax, der gesteigerten Aktivität bzw. Spaltung der Caspasen 3, 7 und 9 sowie der Zunahme der Zellen in der SubG1-Phase gezeigt werden konnte. Durch transiente Hemmung der Expression der einzelnen CDKs mittels siRNA konnte gezeigt werden, dass eine verminderte Expression von CDK2 und CDK7 keinen wesentlichen Einfluss auf die Viabilität der Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 hat, während eine RNAi-vermittelte Hemmung der Expression von CDK9 oder CDK7 und CDK9 in Kombination die Viabilität der UKF-NB-3 Zellen erheblich negativ beeinflusst. Dieser negative Einfluss auf die Viabilität sowie auf die Aktivität der RNA-Polymerase II ist bei Kombination der siRNAs gegen CDK7 und CDK9 am stärksten. Der negative Effekt auf die Viabilität durch eine RNAi-vermittelte verminderte Expression von CDK9 konnte in an Cisplatin und Vincristin adaptierten chemoresistenten Sublinien von UKF-NB-3 ebenfalls nachgewiesen werden. SNS-032 führt in Neuroblastomzellen zu einer deutlich verminderten Phosphorylierung des CDK2 Zielproteins Rb sowie des Zielproteins der CDKs 7 und 9, der RNA-Polymerase II an Serin 2 und 5. Diese wird dadurch nachweislich erheblich in ihrer Aktivität beeinträchtigt. Um zu untersuchen, inwiefern die inhibierte Aktivität der RNA-Polymerase II einen Einfluss auf die Expression verschiedener Proteine mit einer hohen Fluktuationsrate hat, wurden in dieser Arbeit erstmals alle bisher mit der Wirkung von SNS-032 im Zusammenhang betrachteten antiapoptotischen Proteine auf ihre Expression in drei Neuroblastomzelllinien untersucht. Die verminderte RNA-Polymerase II Aktivität führt abhängig vom biologischen Kontext der Neuroblastomzelllinie zu einer differenziell verminderten Expression von Mcl-1, Survivin, XIAP, cIAP-1, cIAP-2 und Bcl-2. Während in anderen Arbeiten zu SNS-032 hauptsächlich die verminderte Expression von Mcl-1 als apoptoseauslösend postuliert wurde, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass in Neuroblastomzellen eine RNAi-vermittelte verminderte Expression von Survivin einen deutlich stärkeren Effekt auf die Viabilität ausübt. Zusammenfassend stellt SNS-032 eine Therapiemöglichkeit für ABCB1-negative bzw. schwach ABCB1-expremierende Neuroblastome dar. Der hauptsächliche Wirkmechanismus wird über die Inhibierung von CDK9 realisiert und führt zu einer verminderten Expression antiapoptotischer Proteine, was nachfolgend eine intrinsische Apoptose auslöst.

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