Untersuchung des CDK2, 7 und 9 Inhibitors SNS-032 in chemosensitiven und chemoresistenten Neuroblastomzellen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde SNS-032, ein niedermolekularer Inhibitor für die Cyclin-abhängigen Kinasen (cyclin dependent kinases, CDKs) 2, 7 und 9, erstmals im Neuroblastom auf seine antitumorale Wirkung untersucht. In dieser Arbeit wurde SNS-032 in einer Auswahl von 113 Neuroblastomzelllinien, bestehend aus 19 parentalen Zelllinien und 94 Sublinien mit einer erworbenen Resistenz gegenüber 14 verschiedenen Zytostatika, untersucht. Bei 73% der untersuchten Zelllinien und 4 weiteren primären Neuroblastomkulturen lagen die Konzentrationen von SNS-032, welche die Viabilität um 50% beeinträchtigen, im therapeutisch erreichbaren Bereich von < 754 nM. In 62% der Zelllinien und zwei primären Neuroblastomkulturen konnte die Viabilität sogar um 90% reduziert werden. Durch Kombination mit konventionellen Zytostatika konnte dieser Effekt in UKF-NB-3 und in an Melphalan, Topotecan und Cisplatin adaptierten Sublinien noch zusätzlich gesteigert werden. SNS-032 beeinträchtigte ebenfalls das Wachstum der an Cisplatin-adaptierten UKF-NB-3 Sublinie UKF-NB-3rCDDP1000 in Mäusen. Es wurde des Weiteren erstmals untersucht, inwiefern die Expression der ABC-Transporter ABCB1 und ABCG2 die Wirkung von SNS-032 beeinflusst. Durch pharmakologische Inhibierung von ABCB1 in stark ABCB1- und ABCG2-expremierenden und weiteren stark ABCB1-expremierenden chemoresistenten Sublinien konnte eine starke ABCB1-Abhängigkeit von SNS-032 nachgewiesen werden. Dies konnte durch RNAi-vermittelte Verminderung von ABCB1 in UKF-NB-3ABCB1 Zellen und nachfolgende Resensibilisierung gegenüber SNS-032 bestätigt werden. Des Weiteren konnte in UKF-NB-3 Zellen (UKF-NB-3rSNS-032300nM), welche durch Adaptierung an steigende Konzentrationen von SNS-032 etabliert wurden, die Expressionsinduktion von ABCB1 und eine dadurch bestehende Kreuzresistenz gegenüber verschiedenen ABCB1-Substraten als hauptsächlicher Resistenzmechanismus gegenüber SNS-032 nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wird die Wirkung von SNS-032 durch ABCG2 in UKF-NB-3ABCG2 Zellen zwar signifikant, jedoch in einem deutlich geringeren Maße beeinflusst. Mit Hilfe der p53-depletierten Zelllinien UKF-NB-3pcp53 und IMR-32pcp53 sowie diverser an Nutlin-3 adaptierten UKF-NB-3 und -6 Sublinien, welche Mutationen im TP53-Gen aufwiesen, konnte nachgewiesen werden, dass die Wirkung von SNS-032 in Neuroblastomzellen unabhängig von funktionellem p53 Protein ist. SNS-032 löst in Neuroblastomzellen eine intrinsisch Apoptose aus, was durch den Nachweis des Verlustes des mitochondrialen Membranpotentials, der Aktivierung von Bax, der gesteigerten Aktivität bzw. Spaltung der Caspasen 3, 7 und 9 sowie der Zunahme der Zellen in der SubG1-Phase gezeigt werden konnte. Durch transiente Hemmung der Expression der einzelnen CDKs mittels siRNA konnte gezeigt werden, dass eine verminderte Expression von CDK2 und CDK7 keinen wesentlichen Einfluss auf die Viabilität der Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 hat, während eine RNAi-vermittelte Hemmung der Expression von CDK9 oder CDK7 und CDK9 in Kombination die Viabilität der UKF-NB-3 Zellen erheblich negativ beeinflusst. Dieser negative Einfluss auf die Viabilität sowie auf die Aktivität der RNA-Polymerase II ist bei Kombination der siRNAs gegen CDK7 und CDK9 am stärksten. Der negative Effekt auf die Viabilität durch eine RNAi-vermittelte verminderte Expression von CDK9 konnte in an Cisplatin und Vincristin adaptierten chemoresistenten Sublinien von UKF-NB-3 ebenfalls nachgewiesen werden. SNS-032 führt in Neuroblastomzellen zu einer deutlich verminderten Phosphorylierung des CDK2 Zielproteins Rb sowie des Zielproteins der CDKs 7 und 9, der RNA-Polymerase II an Serin 2 und 5. Diese wird dadurch nachweislich erheblich in ihrer Aktivität beeinträchtigt. Um zu untersuchen, inwiefern die inhibierte Aktivität der RNA-Polymerase II einen Einfluss auf die Expression verschiedener Proteine mit einer hohen Fluktuationsrate hat, wurden in dieser Arbeit erstmals alle bisher mit der Wirkung von SNS-032 im Zusammenhang betrachteten antiapoptotischen Proteine auf ihre Expression in drei Neuroblastomzelllinien untersucht. Die verminderte RNA-Polymerase II Aktivität führt abhängig vom biologischen Kontext der Neuroblastomzelllinie zu einer differenziell verminderten Expression von Mcl-1, Survivin, XIAP, cIAP-1, cIAP-2 und Bcl-2. Während in anderen Arbeiten zu SNS-032 hauptsächlich die verminderte Expression von Mcl-1 als apoptoseauslösend postuliert wurde, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass in Neuroblastomzellen eine RNAi-vermittelte verminderte Expression von Survivin einen deutlich stärkeren Effekt auf die Viabilität ausübt. Zusammenfassend stellt SNS-032 eine Therapiemöglichkeit für ABCB1-negative bzw. schwach ABCB1-expremierende Neuroblastome dar. Der hauptsächliche Wirkmechanismus wird über die Inhibierung von CDK9 realisiert und führt zu einer verminderten Expression antiapoptotischer Proteine, was nachfolgend eine intrinsische Apoptose auslöst.

In the present time, treatment of high-risk neuroblastoma patients, representing about half of all diagnosed cases, leads to a survival rate of less than 50%. Therefore, new treatment options for high-risk patients are urgently needed. In the present work, SNS-032, a small molecule inhibitor of the CDK2, 7 and 9, was first investigated in neuroblastoma for its antitumor effect. A panel of 113 neuroblastoma cell lines, consisting of 19 parental cell lines and 94 sublines with acquired resistance to 14 different cytotoxic drugs was investigated. 73% of the analyzed cell lines and four primary neuroblastoma cultures showed concentrations of SNS-032 affecting the viability by 50% in a therapeutically achievable range (< 754nM). In 62% of the cell lines and two primary neuroblastoma cultures the viability could even be reduced by as much as 90% in this concentration range. Combination with conventional cytotoxic drugs could increase the effect on the viability in UKF-NB-3 and in melphalan, topotecan and cisplatin adapted sublines. SNS-032 also affected the growth of the cisplatin adapted UKF-NB-3 subline UKF-NB-3rCDDP1000 in mice. Since many sublines adapted to vinca alkaloids, taxanes or doxorubicin show resistance towards SNS-032, we investigated for the first time the direct influence of ABCB1 and ABCG2 expression, both ABC transporters, on the effect of SNS-032. Therefore, the ABCB1 or ABCG2-expressing cell lines UKF-NB-3ABCB1 and UKF-NB-3ABCG2 were used. Pharmacological inhibition of ABCB1 in this and other high ABCB1-expressing chemo-resistant sublines showed a strong ABCB1-dependence of SNS-032 antitumoral activity. Furthermore in SNS-032 resistant UKF-NB-3 cells (UKF-NB-3rSNS-032300nM), which were established by adaptation to increasing concentrations of SNS-032, the induction of ABCB1 expression and cross-resistance to various ABCB1 substrates could be identified as main mechanism of resistance towards SNS-032. In contrast, the effect of SNS-032 by ABCG2 in UKF-NB-3ABCG2 is indeed significant, but affects cells to a significantly smaller extent. SNS-032 exerted its effects independently of the presence of functional p53. This was confirmed using the p53-depleted cell lines UKF-NB-3pcp53 and IMR-32pcp53 and various p53-mutated nutlin-3-resistant UKF-NB-3 and -6 sublines. SNS-032 induces intrinsic apoptosis in neuroblastoma cells, which was confirmed by detection of loss of mitochondrial membrane potential, activation of Bax, increased activity or cleavage of caspases 3, 7 and 9 and an increased amount of cells in subG1 phase. By transient depletion of CDKs using specific siRNAs it could be shown that a decreased expression of CDK2 and CDK7 had no significant impact on the viability of the neuro-blastoma cell line UKF-NB-3, but RNAi-mediated depletion of CDK9 or CDK7 and 9 in combination was effective in affecting the viability. The negative impact on cell viability as well as activity of RNA polymerase II was most pronounced by combination of siRNAs against CDK7 and CDK9. The negative effect on cell viability by RNAi-mediated depletion of CDK9 was also demonstrated in cisplatin and vincristine adapted chemoresistant UKF-NB-3 sublines. According to Western blot analysis in neuroblastoma cells SNS-032 treatment leads to a significantly reduced phosphorylation of CDK2 target protein Rb at serine 807 and 811, and the target protein of CDKs 7 and 9, RNA polymerase II at serine 2 and 5, which adversely affects its activity. To investigate the influence of the inhibited RNA polymerase II activity on the expression of various cellular proteins with a high turnover rate all previously with the effect of SNS-032 considered antiapoptotic proteins were investigated in three neuroblastoma cell lines for their expression. The reduced RNA polymerase II activity results in a differential reduced expression of Mcl-1, Survivin, XIAP, cIAP-1, cIAP -2, and Bcl-2, depending on the biological context of the different neuroblastoma cell line. While in other studies about SNS-032 the decreased expression of Mcl-1 has been postulated as the main trigger for apoptosis, in this work it was shown that in the neuroblastoma cell line UKF-NB-3 the RNAi-mediated depletion of survivin had a much stronger effect on the cell viability as Mcl-1. In summary, SNS-032 is a treatment option for ABCB1-negative or weakly ABCB1-expressing neuroblastoma. The principal mechanism of action is via the inhibition of CDK9 and leads to reduced expression of antiapoptotic proteins, leading to intrinsic apoptosis.