Adaptation von Stäbchenzellen der Froschretina an Hintergrundslicht verschiedener Intensitäten und Einfluss von Stickstoffmonoxid auf die Rückstellphase der Lichtantwort

Abstract

In dieser Arbeit wurde versucht, durch ein elektrophysiologisches Verfahren einen wichtigen Aspekt der Phototransduktion, nämlich die Anpassung von Photorezeptoren an Hintergrundsbeleuchtung unterschiedlicher Intensität anhand von Veränderungen in den registrierten elektrischen Signalen zu erfassen und in Verbindung mit Veränderungen, hervorgerufen durch einen extrazellulär applizierten NO-Donator (Nitroprussidnatrium), zu bringen. Als Grundlage diente die Annahme der Existenz eines endogenen NO/cGMP Signalweges als zusätzlichen Regulierungsmechanismus der Homöostase der freien cGMP Konzentration im Photorezeptoraußensegment. Frei präparierte und in Ringer-Lösung inkubierte intakte Stäbchenzellen des Grasfrosches Rana temporaria wurden für die Registrierungen mit dem Innensegment in eine Glaselektrode gesaugt. Die mit dieser Methode registrierten Lichtantworten zeigten eine charakteristische Verlaufskurve mit einer raschen initialen Spitze, über 90% der Maximalantwort wurde innerhalb der ersten 200- 400 ms erreicht, sowie intensitätsabhängig unterschiedlich langem Plateau mit S-förmigem Ausklingen der Lichtantwort. Die Streuung sowohl in der Amplitude als auch in dem zeitlichen Verlauf der Rückbildungsphase war in den Registrierungen an verschiedenen Zellen, teilweise auch methodisch bedingt, relativ breit. Um derartige Einflüsse zu eliminieren wurden zwei Strategien verwendet:

Wenn die äußeren Bedingungen konstant gehalten werden und nur eine Variable verändert wird, sei es Licht oder eine Substanz im extrazellulären Milieu , sollten alle unmittelbaren Veränderungen des registrierten Signals derselben Zelle darauf zurückzuführen sein In der statistischen Analyse der Ergebnisse sollten Fehler aufgrund der Streuung zwischen den verschiedenen Zellen durch die Versuchsplanung und Wahl eines geeigneten Tests ausgeschaltet werden. Die Applikation von Hintergrundslicht ansteigender Intensität verursachte Beschleunigung der Rückbildungszeit der Lichtantwort, gefolgt von Amplitudenverkleinerung bei höheren Intensitäten als Zeichen von Adaptationsmechanismen in der Zelle. Extrazelluläre Applikation von Natriumnitroprussid als NO Donator zeigte im niedrigen Intensitätsbereich der applizierten Lichtreize einen statistisch signifikanten Effekt auf Amplitude und Rückbildungszeit, der kongruent mit einer Aktivierung einer löslichen Guanylat-Zyklase ist und durch eine Verschiebung des cGMP Gleichgewichts Richtung Synthese erklärt werden kann. Diese Veränderungen waren in der Richtung aber nicht in dem Ausmaß vergleichbar mit den Veränderungen durch das Hintergrundslicht. Im subsättigenden Intensitätsbereich ist eine endogene Modulation der Phototransduktion durch NO im Sinne eines additiven Adaptationsmechanismus dadurch sehr plausibel. Warum die Effekte von Stickstoffmonoxid auf die elektrische Lichtantwort der Stäbchen gerade bei höheren Intensitäten in den Sättigungsbereich hinein schwinden, ist nicht klar. Es ist gut möglich, dass weitere endogene Mechanismen die Wirkung von NO aufheben. Die physiologische Bedeutung und die Regulationsmöglichkeiten des NO/cGMP Signalweges auf der ersten Ebene der Signalverarbeitung in der Retina sind möglicherweise komplexer als die derzeitige Datenlage erfasst und erklären kann, aber umso faszinierender.

Flash response recovery of photoreceptors is the result of several biochemical reactions that end up with restoring the cGMP-concentration in the photoreceptor outer segment to preillumination levels. Nitric Oxide (NO) is known to increase the formation of cGMP in several tissues through the activation of soluble guanylate cyclases. Since rod outer segments were reported to contain guanylate cyclase activity in the cytosol which was highly activated by sodiumnitroprusside, anitric oxide generating agent, it is thinkable that NO could enhance the termination of the light response via such an activation and therefore play a modulatory role in the phototransduction process. The main aim of the present study was to investigate the effect of extracellularly applied sodium nitroprusside on the amplitude and recovery time of rod flash responses in order to test the hypothesis that NO can act as an additional retrograde second messenger in visual transduction. The method that was used is known as the pipette suction technique, all registrations were obtained from the inner segments of single intact rods of dark adapted frogs (Rana temporaria) through a computer-controlled current-to voltage converter system. The parameters amplitude and time course of the recovery of the light responses of every tested cell respectively before and during background light in the first series and before and during perfusion with sodium- nitroprusside in the second series were statistically analyzed with the Wilcoxon Signed-Rank Test. The results of both series were also compared with each other. As expected there was a significant decrease of the maximal amplitude of the light response under background illumination and an acceleration of the recovery phase of the rods as signs of adaptation. There was also a significant decrease of the maximal amplitude (p<0.01) and acceleration (p<0.05) of the recovery at the same light flashes of low intensity under nitroprusside influence, even though not as strong as those under the background light. No significant changes in both parameters were seen at the higher light intensities under NO; on the contrary there was a tendency of increase of the amplitude and prolongation of the recovery of the light response at light flashes towards saturating levels (1000- 2000 photons µm 2 s 1).Nitric Oxide enhances response termination at non-saturating low light flashes and reduces the photosensitivity of the rods probably through early activation of cGMP synthesis and could therefore act as an additional modulating factor in adaptation. Why these effects attenuate by increasing the intensity of the applied flashes needs further investigation.