Zytokin-regulierte Veränderungen von messenger Ribonucleoprotein-Partikeln in humanen retinalen Pigmentepithelzellen

Abstract

Entzündungsreaktionen werden von Zytokinen, einschließlich Mitgliedern der Interleukin-1-Familie, gesteuert und koordiniert. Die Bindung von IL-1 an seinen heterodimeren Rezeptor initiiert Signaltransduktionskaskaden, die die de novo Synthese und die posttranskriptionelle Prozessierung von pro- und antiinflammatorisch wirkenden mRNAs (z.B. IL8, IL6, NFKBIA) regulieren. Die Interaktion von mRNAs mit Proteinen in Form von RNP-Partikeln beeinflusst den gesamten Lebenszyklus eines RNA-Moleküls, inklusive dem mRNA-Abbau. Der deadenylierungsabhängige mRNA-Abbau in 5‘-3‘-Richtung stellt einen Hauptweg dar, bei dem unter anderem die decapping-Faktoren DCP1a und DCP2, decapping-Aktivatoren EDC3 und EDC4 und die 5‘-3‘-Exoribonuklease XRN1 beteiligt sind. Diese Proteine aggregieren dynamisch mit Poly(A)-mRNAs in zytoplasmatischen Foci, die als P-bodies bezeichnet werden. Bisher erfolgten die meisten Untersuchungen in transformierten Säugetierzelllinien oder in Hefen. Die (patho-) physiologische Rolle von P-bodies in höheren Eukaryoten ist noch nicht ausreichend geklärt, es werden jedoch allgemein insbesondere zwei Hypothesen vertreten. Einerseits gibt es Hinweise, dass P-bodies eine Rolle beim mRNA-Abbau spielen, andererseits sprechen Beobachtungen für eine Funktion bei der Speicherung von mRNAs und P-body-Proteinen unter bestimmtem Stressbedingungen. Veröffentlichte Daten aus der AG Kracht haben gezeigt, dass IL-1 die Phosphorylierung von DCP1a an Serin 315 über JNK und TRAF6 fördert und die P-body-Assemblierung in HEK293-IL1R-Zellen induziert, was auf eine Zytokin-abhängige Zusammensetzung von P-bodies hinweist. Ziel dieser Dissertation war es, in diesem Kontext, die Bildung und den mRNA-Gehalt von P-bodies nach IL-1-Stimulation in hTERT-RPE1-Zellen, als humane epitheliale und diploide Zelllinie, zu untersuchen. Untersuchungen zur Kinetik der IL-1-induzierten Genexpression weisen auf eine schnelle Induktion der NF-B-Zielgene IL6, IL8 und NFKBIA auf Ebene der Transkription mit gleichzeitiger Destabilisierung am Höhepunkt der Zytokin-vermittelten mRNA-Induktion hin. Die Veränderungen der basalen und IL-1-abhängigen mRNA-Stabilitäten wurden durch eine detailierte Visualisierung von Transkripten und P-bodies nach Inhibierung der Transkription durch eine Behandlung mit Actinomycin D unterstützt. Diese Daten verdeutlichen ein dynamisches Umordnen von P-bodies in menschlichen diploiden Zellen und können für eine vorübergehende Speicherung „wertvoller“ mRNAs während einer Zytokin-abhängigen Entzündung sprechen. Einen IL-1-abhängigen Effekt auf die Aggregation endogener P-body-Proteine konnte nicht verzeichnet werden. In weiterführenden Experimenten wurde die P-body-Zusammensetzung durch Überexpression oder Depletion einzelner P-body-Proteine gestört und visualisiert. Wie auch schon in HeLa-Zellen nachgewiesen, konnte ein Auflösen der P-bodies durch Überexpression und Depletion von EDC4 beobachtet werden, was für eine essenzielle Rolle dieses scaffolding-Proteins für die P-body-Bildung spricht. Weiterhin konnte ein XRN1-abhängiger destabilisierender und ein EDC4-abhängiger stabilisierender Effekt auf IL-1-abhängige Transkripte beobachtet werden, was die Funktion von P-bodies bei der Entzündungsreaktion im menschlichen Körper hervorhebt.