Immunhistologischer Nachweis von Leukozyten, MHC-II Antigen und Gefäßendothelien am Corpus luteum der Hündin im Verlauf des Zyklus

Abstract

Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, Wachstumsfaktoren, deren Rezeptoren und verschiedene Leukozytenmarker im Corpus luteum der Hündin immunhistochemisch nachzuweisen. Dies sollte in Abhängigkeit verschiedener Zyklusstadien geschehen: Hündinnen wurden an den Tagen 15, 30, 45, 60 und 75 nach dem Sprung des Plasmaprogesteronspiegels über 5ng/ml ovariohysterektomiert. Die gewonnenen Gelbkörper wurden für die Immunhistochemie schockgefroren. Bis auf anti Endoglin, eigneten sich alle heterologen Primärantikörper nicht zur zweifelsfreien Darstellung der gesuchten Moleküle. Zum Erfolg geführt werden konnten Antikörper gegen folgende canine Epitope: CD4, CD8, MHC-II und Endoglin. Die Stärke der Immunreaktion des Antikörpers gegen MHC-II und Endoglin wurde durch den Computer erfaßt (CAVIA: Grauwerte und Flächenanteile der Immunreaktion). Die Zahl der durch anti CD4+ markierten Leukozyten wurde durch den Computer erhoben, die der CD8+ Lymphozyten von Hand. MHC-II Epitope färbten sich im jungen und alten Gelbkörper (Tage 15 und 75) hoch signifikant gegenüber den übrigen Tagen stärker an. Endoglin ist differenzierter zu betrachten: Sein Flächenanteil ist am Tag 15 am größten, während die Stärke der Immunreaktion kontinuierlich zum Tag 75 hin abnimmt. An den Tagen 15 und 60 wurden 6,5, respektive 7,3 CD8+ Zellen je mm² gezählt, während an den übrigen Tagen die Werte zwischen 2,5 und 4,6 Zellen je mm² lagen. Mit 21,6 am Tag 15 und zwischen 6,6 und 8,7 Zellen je mm² wurden CD4+ T-Lymphozyten ausgezählt. Das Verhältnis von CD4+ zu CD8+ Lymphozyten glich sich vom Tag 15 mit einem starken Überschuß an CD4+ Zellen (3,4) bis zum Tag 60 aus, um dann gegen Ende des Zyklus annähernd Werte wie im Blute zu erreichen (2,5). Endoglinpositive (aktivierte) Makrophagen waren nur an Gefäßen zu beobachten. Als MHC-II positive Zellen stellten sich dar (ohne ihre Gewichtung innerhalb der Gruppe erhoben zu haben): Makrophagen, T-Lymphozyten, Endothelien und APC. Dem MHC-II Molekül kommt zusammen mit Makrophagen eine wesentliche Rolle sowohl beim Aufbau, als auch bei der Regressi-on des Corpus luteums zu. Die Beteiligung zytotoxischer T-Lymphozyten an der Luteolyse scheint gesichert. T-Helferzellen sind offenbar nur in der frühen Lutealphase entscheidend beteiligt. Die Rolle des Gefäßsystems bei der Luteolyse ist bisher offensichtlich in der Literatur überschätzt worden. Gerade die Interaktion von Makrophagen, MHC-II Molekül und CD8+ T-Lymphozyten mit Gefäßendothelien und Lutealzellen sowohl bei Auf- als auch bei Abbau des caninen Corpus luteums bedarf näherer Betrach-tungen, v.a. hinsichtlich der wahrscheinlich grundlegend beteiligten Cytokine IFNgamma und TNFalpha.

This investigation has the following objectives: Detection of growth factors, their receptors and leukocyte subsets at different stages of canine corpus luteum development.Ovaries from bitches were taken at day 15, 30, 45, 60 and 75 after an increase of plasma progesterone above 5ng/ml and prepared for immunhistochemical detection. All heterologeous antibodies, except Endoglin, were not suitable for precise detection of their targets. Proper results could be obtained from the following anti-bodies: anti canine CD4, anti canine CD8, anti canine MHC-II and anti human Endoglin. Computer-assisted video image analysis (CAVIA) was used to determine the strength of the immunhisto-chemical reaction of MHC-II and endoglin antibodies by using grey scale pictures. Same pictures were also used to get the occupied area of immunreaction. CD8 positive leukocytes were counted manually and CD4 positive leukocytes through computer image processing. MHC-II epitope expression was significantly elevated on days 15 and 75. Endoglin has to be described in a different manner: The immunpositive area peaked at day 15 whereas im-munstrength decreased continuously from day 15 on. Cytotoxic T-lymphocytes (CD8+) were highest on day 15 and 60 (6.5 and 7.3) and on the other days between 2.5 and 4.6 cells per mm². The highest number of CD4 positive cells was counted on day 15 (21.6) whereas the figure for the remaining days was between 6.6 and 8.7 cells per mm². Following a start ratio of 3:4 on day 15 the CD4 / CD8 ratio balanced at day 60 (1:1) and was 2.5:1 at day 75. Endoglin marked activated macrophages could only be observed along blood vessels. Following cells were MHC-II positive (without checking their distribution within their group): macrophages, T-lymphocytes, endothelial cells and antigen presenting cells. Macrophages and the MHC-II antigen seem to play a major role in establishment and regression of the canine corpus luteum. Also cytotoxic T-lymphocytes seem to participate at luteal regression, whereas CD4+ cells are only involved in the early luteal phase. From our data it may be concluded that the effects of vascularisation in luteolysis seems to be overestimated. Further research should therefore concentrate on the interaction of macrophages, MHC-II antigen and cytotoxic lymphocytes with endothelial and luteal cells in the freshly developing and regressing corpus luteum, especially in the focus of the involvement of the cytocines IFNgamma and TNFalpha.