Untersuchungen zur funktionellen und strukturellen Charakterisierung renaler Phosphattransportsysteme bei kleinen Wiederkäuern

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die kinetischen Parameter des apikalen Na+-abhängigen Pi-Transportsystems der Ziegen- und Schafniere und ein möglicherEinfluß der alimentären P- und Ca-Versorgung auf die Transporteigenschaften untersucht. Für die Untersuchungen wurden Bürstensaummembranvesikel(BSMV) verwendet, die mittels Mg+-EGTA-Präzipitation und anschließender Differentialzentrifugation aus Nierencortices von 3-4 Monate alten Ziegen- undSchaflämmern isoliert wurden. Die Bestimmung der Pi-Aufnahme in die BSMV erfolgte mittels Schnellfiltration und 32P als Tracer. Um methodischvergleichbare Daten für eine monogastrische Spezies zu erhalten, wurden Kontrollversuche mit BSMV-Präparationen von Schweinenieren durchgeführt. Mit Hilfe von RT-PCR und DNA-Sequenzierung wurde außerdem geprüft, inwieweit die so charakterisierten Pi-Transportsysteme von Ziege, Schaf undSchwein Homologien mit dem in der Rattenniere beschriebenen Na+/Pi-Cotransporter des Typs II aufweisen. Die Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Die maximale Pi-Aufnahmeraten (Vmax) des renalen Na+-abhängigen Pi-Transportsystems von Ziegen waren unabhängig von der alimentärenCa-Versorgung (Kontrolle : 1,98 ± 1,21 nmol.mg-1 Protein.10 s-1 (8); Ca-Depletion: 1,93 ± 0,99 nmol.mg-1 Protein.10 s-1 (8); Mittelwert ± SD (n)), stiegenaber in Folge der P-Depletion um ca. 50 % an (P-Depletion: 2,99 ± 2,2 nmol.mg-1 Protein.10 s-1 (8)). Allerdings war dieser Effekt nicht signifikant. Die Pi-Affinitäten (Km) des Pi-Transportsystems wurden durch keine der Fütterungsvarianten signifikant beeinflußt (Kontrolle: 0,34 ± 0,14 mmol.l-1 (8);P-Depletion: 0,35 ± 0,07 mmol.l-1 (8); Ca-Depletion: 0,28 ± 0,17 mmol.l-1 (8)). 2. Bei Schafen hatte die P-Depletion weder auf die Vmax-Werte (Kontrolle: 1,39 ± 0,56 nmol.mg-1 Protein.10 s-1 (3); P-Depletion: 1,03 ± 0,6 nmol.mg-1Protein.10s-1 (3)) noch auf die Km-Werte (Kontrolle: 0,55 ± 0,21 mmol.l-1 (3); P-Depletion: 0,33 ± 0,29 mmol.l-1 (3)) einen signifikanten Einfluß. 3. Im Vergleich lagen die Vmax-Werte der Ziegen um ca. 40 % höher als die für Schaf und die für das Schwein (0,95 ± 0,07 nmol.mg-1 Protein.10s-1(3))ermittelten. Bei beiden Wiederkäuerspezies war die Km um das 3-5-fache geringer als beim Schwein (0,11 ± 0,002 mmol.l-1 (3)); (p<0,01). 4. Bei alimentärem P-Mangel stieg die Na+-Transportkapazität (Vmax,app) des renalen Na+-abhängigen Pi-Transportsystems der Ziegen um ca. 110 % an(Kontrolle 1,37 ± 0,57 nmol.mg-1 Protein.10 s-1 (12); P-Depletion: 2,89 ± 2,21 nmol.mg-1 Prote-in.10 s-1 (8)). Dieser Effekt war nicht signifikant. DieCa-Versorgung übte keinen wesentlichen Einfluß auf die Vmax,app-Werte aus (Ca-Depletion: 1,3 ± 0,96 nmol.mg-1 Protein.10 s-1 (8)). Die Affinität desPi-Transportsystems für Na+-Ionen (K[0,5]Na) wurde durch keine der Fütterungsvarianten signifikant beeinflußt (Kontrolle: 95,9 ± 16,3 mmol.l-1 (12);P-Depletion: 128,1 ± 43,1 mmol.l-1 (8); Ca-Depletion: 114,6 ± 35,4 mmol.l-1 (8)). 5. Bei Schafen hatte die P-Depletion weder auf die Vmax,app-Werte (Kontrolle: 0,43 ± 0,1 nmol.mg-1 Protein.10 s-1 (3); P-Depletion: 0,57 ± 0,16 nmol.mg-1Protein.10 s-1 (3)) noch auf die K[0,5]Na-Werte (Kontrolle: 81,0 ± 10,0 mmol.l-1 (3); P-Depletion: 93,8 ± 14,5 mmol.l-1 (3)) einen signifikanten Einfluß. 6. Die bei Ziegen ermittelte Vmax,app (1,37 ± 0,57 nmol.mg-1 Protein.10s-1 (12)) lag signifikant höher (p<0,05) als bei Schafen (0,43 ± 0,1 nmol.mg-1Protein.10s-1 (3)) und Schweinen (0,58 ± 0,09 nmol.mg-1 Protein.10s-1 (3)). Die K[0,5]Na-Werte waren bei beiden Wiederkäuerspezies kleiner undunterschieden sich jedoch nur zwischen Ziege (95,9 ± 16,3 mmol.l-1 (12)) und Schwein (61,0 ± 1,06 mmol.l-1 (3)) signifikant (p<0,05). 7. Für alle Spezies konnte ein Hill-Koeffizient >2 berechnet werden. Im Speziesvergleich lag der für die Schafe berechnete Hill-Koeffizient (2,35 ± 0,1 (3))signifikant niedriger (p<0,01) als der von Ziegen (3,01 ± 0,33 (12)) und Schweinen (3,32 ± 0,19 (3)). Ein signifikanter Einfluß der Fütterung auf dieStöchiometrie des Na+-abhängigen Pi-Transportes konnte weder bei Ziegen noch bei Schafen beobachtet werden. 8. Mit RT-PCR konnten mit für den Na+/Pi-Cotransporter Typ II der Rattenniere spezifischen Primern sowohl in der Schweine- als auch in der Ziegen- undSchafniere vergleichbare Fragmente von ca. 768 Basenpaaren amplifiziert werden. 9. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen des klonierten PCR-Fragmentes ergab folgenden Grad der Homologie: Ziege/Ratte 90 %, Schaf/Ratte 89 %,Schwein/Ratte 89 %, Ziege/Schaf 98 %, Ziege/Schwein 94 % und Schaf/Schwein 92 %. Diese Ergebnisse zeigen eine strukturelle Verwandtschaft der renalen Pi-Transportsysteme von Ziege, Schaf und Schwein mit dem Na+/Pi-Cotransporter TypII in der Rattenniere, aber auch deutliche funktionelle Unterschiede des renalen Pi-Transportsystems von Wiederkäuern im Vergleich zum Schwein. In weiterenUntersuchungen sollte die molekulare Struktur des gesamten Transportproteins identifiziert werden, um durch gerichtete Mutagenese die strukturellenUnterschiede auf ihre Funktion hin überprüfen zu können.