Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wichtige Rolle in biologischen Systemen. ROS gewinnen bei einer Reihe von Krankheiten, aber auch bei physiologischen Regulationsmechanismen, immer mehr an Bedeutung. Deshalb ist es wichtig, ihre Rolle in pathophysiologischen Prozessen, wie z.B. beim ARDS (Adult Respiratory Distress Syndrome), bei Sepsis, beim Ischämie/Reperfusionsschaden und bei Signaltransduktionsmechanismen in biologischen Systemen aufzuklären. Im pulmonalen System wird vermutet, dass reaktive Sauerstoffspezies unter Hypoxie am Mechanismus der Ventilations-Perfusions-Anpassung beteiligt sind. Jedoch ist unklar, ob ROS während alveolärer Hypoxie vermindert oder paradoxerweise vermehrt freigesetzt werden und von welcher Quelle die ROS gebildet werden. Als Quellen kommen u.a. Mitochondrien und NADPH-Oxidasen in Betracht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode zur Detektion von intravaskulär freigesetzten ROS an der isoliert ventilierten und perfundierten Kaninchenlungen etabliert. Hierbei stellte die Kombination aus Elektronspinresonazspektroskopie (ESR-Spektroskopie), Spin-Trapping-Technik und der Methode der isolierten Lunge eine neue Entwicklung dar. Als Spinprobe wurde in der vorliegenden Arbeit das zyklische Hydroxylamin l-Hydroxy-3-Carboxy-2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidin (CPH) benutzt und charakterisiert. CPH wurde in den letzten Jahren zur quantitativen Messung von reaktiven Sauerstoffspezies in biologischen Systemen eingeführt. ROS können mit der Detektion des korrespondierenden Radikals 3-Carboxy-Proxyl (CP.) mittels ESR quantifiziert werden. Durch ESR-Spektroskopie konnte das triple-line Spektrum des CP. Radikals detektiert werden.
CPH hat die Eigenschaft, dass es auch ohne Anwesenheit von Radikalen durch Sauerstoff oxidiert werden kann. Dieser Vorgang wird als Autooxidation bezeichnet. Aus diesem Grund wurde zunächst eine Charakterisierung der Autooxidation notwendig.
Um eine mögliche Sauerstoffabhängigkeit der Superoxidfreisetzung zu untersuchen, wurden die isolierten Lungen alternierend mit verschiedenen inspiratorischen Sauerstoffkonzentrationen ventiliert. Hierbei zeigte sich ein Minimum des ESR-Signals bei 2,5 % O2. Durch Zugabe von Superoxiddismutase (SOD) konnte bei allen Sauerstoffkonzentrationen die ESR-Signalintensität signifikant gesenkt werden. Dies deutet darauf hin, dass ein Anteil des ESR-Signals durch intravaskulär gebildetes Superoxid zustande kommt. Weiterhin kam es unter der Applikation von Phorbolmyristatacetat (PMA) zu einer Vasokonstriktion und zu einem signifikanten Anstieg der CPH-Oxidation. Unter dem Einsatz der SOD ließ sich die PMA induzierte CP˙-Bildung und die Vasokonstriktion komplett hemmen. Zur Untersuchung der Sauerstoffabhängigkeit der PMA induzierten Superoxidbildung wurden mit unterschiedlichen inspiratorischen Sauerstoffkonzentrationen ventiliert. Hierbei zeigte sich die höchste ESR-Signalintensität und die stärkste vasokonstriktive Antwort bei einer inspiratorischen Ventilation mit 5,0% O2.
In neuesten Untersuchungen konnte diese PMA induzierte Vasokonstriktion mit Hilfe eines NADPH-Oxidase Inhibitors gehemmt werden.
Die Daten zeigen, dass die durch PMA induzierte Vasokonstriktion wahrscheinlich durch Superoxid, generiert von NADPH-Oxidasen, vermittelt wird und dass es bei Hypoxie zu einer paradoxen, vermehrten O2.¯ Freisetzung kommen kann. Die Daten lassen weiterhin den Schluss zu, dass in der hypoxieabhängigen Regulation des pulmonalen Gefäßtonuses NADPH-Oxidasen involviert sein könnten. Weiterführende Untersuchungen sollten auf die zelluläre Ebene fokussieren, um die subzelluläre Quelle der hypoxieabhängigen ROS-Bildung zu identifizieren. Weiterhin kann die im Rahmen der vorliegenden Arbeit etablierte Methode zur Untersuchung der ROS-Bildung bei Ischämie/Reperfusion der Lungenstrombahn hilfreich sein.
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