Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies an isoliert perfundiert und ventilierten Kaninchenlungen mittels Elektronenspinresonanz-Spektroskopie

Abstract

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wichtige Rolle in biologischen Systemen. ROS gewinnen bei einer Reihe von Krankheiten, aber auch bei physiologischen Regulationsmechanismen, immer mehr an Bedeutung. Deshalb ist es wichtig, ihre Rolle in pathophysiologischen Prozessen, wie z.B. beim ARDS (Adult Respiratory Distress Syndrome), bei Sepsis, beim Ischämie/Reperfusionsschaden und bei Signaltransduktionsmechanismen in biologischen Systemen aufzuklären. Im pulmonalen System wird vermutet, dass reaktive Sauerstoffspezies unter Hypoxie am Mechanismus der Ventilations-Perfusions-Anpassung beteiligt sind. Jedoch ist unklar, ob ROS während alveolärer Hypoxie vermindert oder paradoxerweise vermehrt freigesetzt werden und von welcher Quelle die ROS gebildet werden. Als Quellen kommen u.a. Mitochondrien und NADPH-Oxidasen in Betracht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode zur Detektion von intravaskulär freigesetzten ROS an der isoliert ventilierten und perfundierten Kaninchenlungen etabliert. Hierbei stellte die Kombination aus Elektronspinresonazspektroskopie (ESR-Spektroskopie), Spin-Trapping-Technik und der Methode der isolierten Lunge eine neue Entwicklung dar. Als Spinprobe wurde in der vorliegenden Arbeit das zyklische Hydroxylamin l-Hydroxy-3-Carboxy-2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidin (CPH) benutzt und charakterisiert. CPH wurde in den letzten Jahren zur quantitativen Messung von reaktiven Sauerstoffspezies in biologischen Systemen eingeführt. ROS können mit der Detektion des korrespondierenden Radikals 3-Carboxy-Proxyl (CP.) mittels ESR quantifiziert werden. Durch ESR-Spektroskopie konnte das triple-line Spektrum des CP. Radikals detektiert werden. CPH hat die Eigenschaft, dass es auch ohne Anwesenheit von Radikalen durch Sauerstoff oxidiert werden kann. Dieser Vorgang wird als Autooxidation bezeichnet. Aus diesem Grund wurde zunächst eine Charakterisierung der Autooxidation notwendig. Um eine mögliche Sauerstoffabhängigkeit der Superoxidfreisetzung zu untersuchen, wurden die isolierten Lungen alternierend mit verschiedenen inspiratorischen Sauerstoffkonzentrationen ventiliert. Hierbei zeigte sich ein Minimum des ESR-Signals bei 2,5 % O2. Durch Zugabe von Superoxiddismutase (SOD) konnte bei allen Sauerstoffkonzentrationen die ESR-Signalintensität signifikant gesenkt werden. Dies deutet darauf hin, dass ein Anteil des ESR-Signals durch intravaskulär gebildetes Superoxid zustande kommt. Weiterhin kam es unter der Applikation von Phorbolmyristatacetat (PMA) zu einer Vasokonstriktion und zu einem signifikanten Anstieg der CPH-Oxidation. Unter dem Einsatz der SOD ließ sich die PMA induzierte CP˙-Bildung und die Vasokonstriktion komplett hemmen. Zur Untersuchung der Sauerstoffabhängigkeit der PMA induzierten Superoxidbildung wurden mit unterschiedlichen inspiratorischen Sauerstoffkonzentrationen ventiliert. Hierbei zeigte sich die höchste ESR-Signalintensität und die stärkste vasokonstriktive Antwort bei einer inspiratorischen Ventilation mit 5,0% O2. In neuesten Untersuchungen konnte diese PMA induzierte Vasokonstriktion mit Hilfe eines NADPH-Oxidase Inhibitors gehemmt werden. Die Daten zeigen, dass die durch PMA induzierte Vasokonstriktion wahrscheinlich durch Superoxid, generiert von NADPH-Oxidasen, vermittelt wird und dass es bei Hypoxie zu einer paradoxen, vermehrten O2.¯ Freisetzung kommen kann. Die Daten lassen weiterhin den Schluss zu, dass in der hypoxieabhängigen Regulation des pulmonalen Gefäßtonuses NADPH-Oxidasen involviert sein könnten. Weiterführende Untersuchungen sollten auf die zelluläre Ebene fokussieren, um die subzelluläre Quelle der hypoxieabhängigen ROS-Bildung zu identifizieren. Weiterhin kann die im Rahmen der vorliegenden Arbeit etablierte Methode zur Untersuchung der ROS-Bildung bei Ischämie/Reperfusion der Lungenstrombahn hilfreich sein.

Reactive oxygen species (ROS) play an important role in biological systems. While it is largely accepted that ROS mediated oxidative damage occurs under pathophysiological conditions, recent evidence suggests a role for ROS as signalling molecules in physiological processes. In the respiratory system, ROS are thought to be involved in the pathogenesis of the adult respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis and ischemia-reperfusion, but may also play a role in the development of hypoxia-and non-hypoxia-induced pulmonary hypertension. In the context of regulatory processes of the lung, a growing body of evidence is emerging indicating that ROS may contribute to signalling events such as underlying hypoxic pulmonary vasoconstriction (HPV), an essential mechanism matching lung perfusion to ventilation in order to optimize pulmonary gas exchange. The question of whether ROS generation is decreased or paradoxically increased during alveolar hypoxia, and the sources from which ROS may be derived under these conditions, are controversial. In fact, evidence exists for both a decrease as well as increase in lung ROS generation during alveolar hypoxia. Both mitochondria and NADPH oxidases have been proposed as sources of ROS generation underlying HPV. In this thesis a method combining electronspinresonance (ESR) spectroscopy with the spin trapping technique for measurement of superoxide release from isolated perfused and ventilated rabbit lungs was established. Superoxide was detected by the cyclic hydroxylamine l-hydroxy-3-carboxy- 2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) which was recently introduced for quantitative ROS measurements in biological systems. ROS formation can be quantified by detection of the corresponding radical 3-carboxy-proxyl (CP.) using ESR spectroscopy. After having proven the feasibility of CPH for ROS detection in the isolated perfused and ventilated rabbit lungs, the autooxidation of CPH was characterized. Perfusing lungs with CPH over a range of different inspired oxygen concentrations revealed an oxygen-dependence of CP. formation rate, with a minimum at 2,5 % O2. Addition of superoxide dismutase (SOD) to the buffer fluid illustrated that a portion of this intravascular ROS release was attributable to superoxide. Intravascular stimulation of the lungs by phorbolmyristateacetate (PMA) caused a rapid increase in CP. formation, concomitant with pulmonary vasoconstriction. Both the PMA-induced CPH oxidation and the vasoconstrictor response were completely suppressed by SOD. When the PMA challenge was performed at different oxygen concentrations, maximum superoxide liberation and pulmonary vasoconstriction occurred at 5,0 % O2. The PMA-induced vasoconstriction in the isolated lung experiments was inhibited by a NADPH-oxidase inhibitor These data demonstrate that the PMA-induced vasoconstriction is caused by superoxide generated from NADPH oxidases and that superoxide release may paradoxical be increased in hypoxia. NADPH oxidases thus may contribute to the hypoxia-dependent regulation of pulmonary vascular tone. Further experiments should be focused on cellular and subcellular sources of the hypoxia-dependent ROS-generation. Furthermore the established method may be helpful to clarify the role of ROS-generation in ischemia/reperfusion in the pulmonary vasculature.