Massenspektrometrische Erforschung des Proteoms neutrophiler Granulozyten von Patienten mit ST-Hebungsinfarkt

Abstract

Ziel der Arbeit: Bei neutrophilen Granulozyten sollten Änderungen im Proteom als Reaktion auf verschiedene Stimuli detektiert werden, um deren pathophysiologische Rolle insbesondere im Rahmen des ST-Hebungs-Myokardinfarktes näher zu erforschen.Material und Methoden: Im Rahmen des ersten (in vivo-)Versuches wurden neutrophile Granulozyten von 3 STEMI-Patienten und 3 gesunden Kontrollen aus Vollblut isoliert. Im zweiten (in vitro-)Versuch wurden neutrophile Granulozyten von 3 gesunden Probanden aus Vollblut isoliert und anschließend jeweils, nebst Kontrollen, mit ATP, LPS und der Kombination aus ATP und LPS stimuliert. Anschließend wurden die in den neutrophilen Granulozyten enthaltenen Proteine mit der Protease Trypsin verdaut. Die daraus resultierenden Peptide wurden in einem Massenspektrometer (LTQ Orbitrap) analysiert und anschließend ausgewertet. So konnten quantitative Rückschlüsse auf die einzelnen in den neutrophilen Granulozyten enthaltenen Proteine gezogen und relative Veränderungen zwischen den Proben berechnet werden.Ergebnisse: In vivo konnten 2059 Proteine identifiziert werden, von welchen 34 Proteine signifikant reguliert waren. Bei den In vitro-Stimulationsversuchen wurden insgesamt 2599 Proteine identifiziert. Signifikant reguliert gegenüber den Kontrollen waren dabei 9 (ATP), 22 (LPS) und 29 (ATP/ LPS) Proteine. Die ATP- und LPS-Versuche zeigten keine proteomischen Überschneidungen. Zwischen den in-vivo und in vitro-Versuchen gab es minimale proteomische Überschneidungen.Diskussion: Bei STEMI-Granulozyten war ein proapoptotischer Proteomshift zu verzeichnen. Weiterhin waren Proteine der Immunantwort, der Zell-Zell-Kommunikation und des Vesikel- und Proteintransportes verstärkt reguliert. Dies bestätigt neutrophile Granulozyten als Immunzellen und legt nahe, dass sie aktiv in das Infarktgeschehen eingreifen und dabei eine maßgebliche Rolle spielen.Die Ergebnisse der Stimulationsversuche zeigten, dass ATP und LPS auf proteomischer Ebene verschiedene Veränderungen in neutrophilen Granulozyten hervorriefen. Dies ist ein Zeichen dafür, dass neutrophile Granulozyten zwischen PAMPs (LPS) und DAMPs (ATP) unterscheiden und auf die septische und die sterile Inflammation jeweils spezialisiert reagieren können. Im Rahmen der simulierten septischen Inflammation waren dabei klassische Immun- und Abwehrprozesse stärker reguliert als nach ATP-Stimulation. Dies spricht dafür, dass die neutrophile Immunantwort auf septische Zustände stärker ausfällt als gegenüber sterilen Stimuli.

The aim of this work was to detect alterations in the proteome of neutrophil granulocytes by means of various stimuli in order to investigate their pathophysiological role - partic-ularly in the context of the ST elevation myocardial infarction (STEMI).Materials and methods: For the first trial (in vivo), neutrophils were isolated from whole blood of 3 STEMI patients and 3 healthy controls. For the second trial (in vitro), neutro-phils were isolated from whole blood of 3 healthy controls and afterwards each sample was divided up and incubated separately with either adenosine triphosphate (ATP), lipo-polysaccharides (LPS) or a combination of ATP/ LPS as stimuli, or kept without stimu-lation (control). The proteins of these neutrophils were digested into peptides using the protease trypsin and then measured with a mass spectrometer (LTQ Orbitrap) and subse-quently analyzed. This way, quantitative information relating to several neutrophil pro-teins could be obtained and fold changes could be evaluated.Results: In vivo, 2059 proteins were identified. 34 of them showed a significantly higher or lower intensity in the STEMI patients. In vitro, 2599 proteins were identified, of which 9 (ATP), 22 (LPS) and 29 (ATP/ LPS) varied significantly in comparison to the controls. Between the ATP and LPS trial no proteomic overlaps could be found. Between in vivo and in vitro trials there were minimal proteomic overlaps.Discussion: In the neutrophils of STEMI-patients we detected a pro-apoptotic proteome shift. Furthermore, proteins participating in the immune answer, cell-cell communication and vesicle and protein transportation were regulated. This confirms the neutrophils´ role as cells of the immune system but also suggests their active participation and an important role in the process of myocardial infarction.The results of the stimulation trials showed that ATP and LPS induced different proteo-mic shifts within neutrophils. This suggests their ability to differentiate between patho-gen-associated molecular patterns (PAMPs - here: LPS) and danger/ damage-associated molecular patterns (DAMPs - here: ATP) and to react in a specialized way to sterile and septic inflammation. In simulated septic inflammation, immune system and defence as-sociated processes were regulated more significantly than in simulated sterile inflamma-tion. This suggests that the neutrophil immune response in septic inflammation is more pronounced than in sterile inflammation.