Analysis of specific functions of Nkx5-1 and Nkx5-2 homeobox genes during neuronal differentiation and apoptosis

Abstract

In the present work I investigated the role of two closely related proteins Nkx5-1 and Nkx5-2 in neuronal apoptosis and differentiation. These two proteins show high sequence conservation in several vertebrate species. It was postulated, that they play overlapping roles in the inner ear and nervous system development. Nkx5-1 and Nkx5-2 are expressed during inner ear development as well as during adult stages in the mouse. In addition to the inner ear structures, they are also expressed in post- mitotic neurons in several central and peripheral locations. Nkx5-1 knockout leads to severe defects of the vestibular apparatus of the inner ear. However, singular Nkx5-1 gene knockout mice did not reveal any obvious neuronal phenotype. Based on the fact that double Nkx5-1/2 (also called Hmx2/3) knockout led to a severe postnatal lethal phenotype, redundant functions for both Nkx5 genes were postulated. In the double knockout mice defects in some hypothalamic functions were documented, however, no neuronal loss was observed in the functionally affected regions and the molecular basis of Nxk5 genes action remains unresolved.To investigate molecular mechanisms of Nkx5-1 and Nkx5-2 genes functions in neuronal cells, PC12 rat pheochromocytoma cells were used as an experimental model. This cell line is a commonly used system for the investigation of the neurogenesis and undergoes neuronal differentiation upon treatment with nerve growth factor NGF. Recently, it was shown that BMP family members, BMP4 and BMP6, support NGF-mediated neuronal differentiation of PC12 cells. In contrast to such coordinated action of BMP and NGF signalling, another BMP- family member, BMP2, is able to stimulate neurite outgrowth in PC12 without NGF.Interestingly, a multifunctional cellular regulator protein p53 was also recently demonstrated to be another player within the NGF-differentiation pathway: p53 knockdown inhibited NGF-induced differentiation. The high affinity NGF receptor TrkA was revealed as a direct target for p53-mediated transcriptional regulation. Depending on the cellular context p53 may regulate TrkA either to induce cell cycle arrest and differentiation or apoptosis.To study the potential role of Nkx5-1 in the adult neuronal structures I used Nkx5-1 knockout mouse strain generated previously in our laboratory.

Nkx5-1 und Nkx5-2 sind zwei eng verwandte Proteine, die wichtige Rollen in der Entwicklung des Innenohrs und der neuronalen Strukturen spielen. Die Expression der Nkx5 Gene sowie die Folgen deren Ausschaltung in der Maus sind bereits beschrieben. Es ist jedoch wenig über die Regulation und Funktion der Nkx5 Gene in neuronalen Zellen bekannt. Das Hauptanliegen dieser Arbeit ist daher eine funktionelle Untersuchung der Nkx5-1 und Nkx5-2 Gene während der Differenzierung von neuronalen Zellen.PC12 Pheochromocytoma Zelllinie wurde als Untersuchungssystem gewählt. Diese Zelllinie wurde ursprünglich von Chromaffin-Zellen der Suprarenal Medulla der Ratte etabliert. Neben der Untersuchung der Expression der endogenen Nkx5 Gene wurden Nkx5 überexprimierende Konstrukte verwendet. Des weiteren wurde ein LacZ-reporter Konstrukt zur Untersuchung von Nkx5-1 Genpromotors-Aktivität generiert.Den wichtigsten Befund dieser Arbeit stellt die Aufdeckung einer Nkx5-1 spezifischen Funktion bei der Induktion der Apoptose dar. Während eine Überexpression des Nkx5-1 Proteins in den PC12 Zellen die Apoptose induzierte, löste dagegen eine Überexpression des Nkx5-2 Proteins keinen derartigen Effekt aus. Mit diesem Befund wurde zum ersten Mal eine molekulare Funktion, die spezifisch für nur eins der beiden Nkx5 Proteine ist, definiert. Bislang wurde eine funktionelle Redundanz der beiden Proteine postuliert.Im weiteren Verlauf dieser Arbeit habe ich die pro-apoptotische Wirkung des Nkx5-1 Proteins genauer untersucht. Da Apoptose als ein wesentlicher Bestandteil des neuronalen Differenzierungsprogramms betrachtet wird, habe ich die potentiellen Wechselwirkungen mit den neuronalen Differenzierungsfaktoren NGF und BMP untersucht. Überaschenderweise haben weder NGF noch BMP mit der Nkx5-1 induzierten Apoptose interferiert. Meine Daten weisen darauf hin, dass die Nkx5-1 induzierte Apoptose im p53-abhängigen Signalweg erfolgt.Um die Proteinbereiche, die für die Nkx5-1 spezifische Funktion verantwortlich sind zu definieren, habe ich s. g. domain swapping (Domänenaustausch) Konstrukte verwendet. In diesen Experimenten konnte der N-Terminus des Nkx5-1 Proteins als verantwortlich für die pro-apoptotische Wirkung identifiziert werden. Dieser Proteinbereich beinhaltet Sequenzen, die unter den beiden Nkx5 Proteinen nicht konserviert sind. Die endogene Nkx5-1 Expression steigt während der neuronalen Induktion und spiegelt möglicherweise die wichtige Rolle des Apoptosevorgangs in der neuronalen Differenzierung wieder. Die erhöhte transkriptionelle Aktivität des Nkx5-1 Gens in differenzierten Zellen wurde zusätzlich durch die Bestimmung der Nkx5-1 Promoter-Aktivität mittels LacZ-Reporter Konstrukts bestätigt. Meine Ergebnisse zeigen, dass sich die regulatorischen Promotorelemente, die für die Nkx5-1 Genaktivität in neuronalen Zellen verantwortlich sind, in einem 10,5 kb Bereich 5´von der Transkriptionsstartstelle befinden. Dieses Genfragment beinhaltet ebenso Sequenzen, die durch NGF und BMP Signale reguliert werden.Im letzten Teil dieser Arbeit habe ich Apoptosevorgänge sowie Expression verschiedener neuronaler Marker im CNS der Nkx5-1 knockout Maus durchgeführt. Ich habe eine verminderte Apoptose in verschiedenen Gehirnregionen der Nkx5-1 -/- Maus dokumentiert. Weiterhin, wurden niedrige Expressionslevel von neuronalen Markergenen gefunden. Diese Daten deuten auf eine regulatorische Rolle von Nkx5-1 im neuronalen Gewebe in vivo.