Investigations on the effect of nicotinic acid supplementation on muscle fiber distribution and muscle metabolic phenotype in pig and sheep

Abstract

Nicotinic acid (NA) is the oldest lipid-lowering drug and has been used for more than five decades in the treatment of atherosclerosis and metabolic disorders. The lipid-lowering mechanism of NA has been extensively investigated and traditionally attributed to its antilipolytic effect on adipocytes through binding with the NA receptor G-protein-coupled receptor 109A (GPR109A). However, the circulating free fatty acid (FFA) level rebound and over-shoot the baseline due to long-term NA treatment even though its lipid-lowering effects persist. Thus, despite a long history of clinical use, to date the precise mechanism by which NA lowers plasma lipid is far from clear. In such a context, in the present thesis it has been hypothesized that NA induces type II to type I muscle fiber transition, thereby increasing the oxidative capacity of overall skeletal muscle, which may be the background mechanism of lipid-lowering properties of NA. It has been already found that NA supplementation counteracts the obesity-induced muscle fiber transition from oxidative type I to glycolytic type II and increases the number of type I fibers in skeletal muscle of obese Zucker rats. These effects were likely mediated by the induction of key regulators of fiber transition, peroxisome proliferator-activated receptor delta (PPARdelta), PPARγ coactivator-1alpha (PGC-1alpha) and PPARgamma coactivator-1beta (PGC-1beta), leading to type II to type I fiber transition and upregulation of genes involved in fatty acid oxidation, mitochondrial oxidative phosphorylation, and angiogenesis. So, the main intention of the present thesis studies was to investigate the hypothesis that, whether NA administration also influences fiber type distribution and thereby the metabolic phenotype of different skeletal muscles in two farm animal species, namely in pig as a model of non-ruminants (study 1) and in sheep as a model of ruminants (study 2). In order to investigate the hypotheses of study 1, twenty five male, 11 weeks old crossbred pigs (Danzucht x Pietrain) with an average body weight of 32.8 ± 1.3 (mean ± SD) kg were randomly allocated to two groups of 12 in control group and 13 pigs in NA group which were fed either a control or a diet supplemented with 750 mg NA/kg diet for 3 weeks. Fiber typing was performed in three different skeletal muscles (M. Longissimus dorsi, LD; M. Quadriceps femoris, QF; M. Gastrocnemius, G) and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was performed in LD muscle only. The percentage numbers of type I fibers in three different skeletal muscles were higher in the NA group and the percentage numbers of type II fibers were lower in the NA group compared to the control group. In line with this, the relative mRNA level of the type I fiber-specific myosin heavy chain, MYH7 gene tended (P < 0.15) to be higher; type II fiber-specific MYH2 and MYH4 genes were reduced or tended (P < 0.15) to be reduced, respectively, in LD muscle in the NA group compared to the control group of pigs. The relative mRNA levels of key regulators of muscle fiber transition, PGC-1beta was increased and PGC-1alpha was numerically increased by NA treatment. Genes involved in mitochondrial fatty acid utilization and thermogenesis [carnitine acylcarnitine translocase, fatty acid transport protein1, novel organic cation transporter 2, succinate dehydrogenase subunit A (SDHA), cytochrome c oxidase 4/1 and 6A1, (COX4/1 and COX6A1) and uncoupling proteins 3] measured in LD muscle were higher in the NA treated pigs compared to control pigs. In order to investigate the hypotheses of study 2, sixteen male, 11 weeks old Rhoen sheep with an average body weight of 29.6 ± 3.0 (mean ± SD) kg were randomly allocated to two groups of 8 sheep each and treated either without (control group) or with 1 g NA per day (NA group) for 4 weeks. After 4 weeks, the percentage numbers of type I fibers in three different skeletal muscles (LD; M. Semimembranosus, SM; M. Semitendinosus, ST) were higher in the NA treated sheep, whereas the percentage numbers of type II fibers were lower in the NA group compared to the control group of sheep. This effect was also reflected by the NA induced increase in the transcript level of fiber type I specific myosin heavy chain I, (MHCI) isoform in SM and ST muscles or tended (P < 0.15) to be increased in LD muscle; the fiber type II specific MHCIIA isoform was lowered in LD and SM muscles; fiber type II specific MHCIIX isoform was lowered in LD and tended (P < 0.15) to be lowered in SM muscle by NA treatment. The relative mRNA levels of the key regulators of muscle fiber transition, PGC-1α, PGC-1β and PPARδ, in all three muscles were higher or tended (P < 0.15) to be higher in the NA treated group compared to the control group sheep. Moreover, the protein level of PGC-1alpha was elevated in two muscles (LD and SM) of the NA group compared to the control group. In line with this, it was observed that the relative mRNA levels of genes involved in fatty acid oxidation and angiogenesis (SDHA, carnitine palmitoyltransferase 1B, solute carrier family 25 member 20, COX5A, COX6A1 and vascular endothelial growth factor A) in all three skeletal muscles of sheep were elevated by NA treatment.In conclusion, the overall finding of the present PhD thesis is that NA causes type II (fast-glycolytic) to type I (slow-oxidative) fiber switch and thereby increases the oxidative capacity in different types of skeletal muscle of pigs and sheep. This increased oxidative skeletal muscle capacity induced by NA might improve the pork quality because the oxidative muscle types tend to develop dark, firm and dry pork in response to intense physical activity and/or high psychological stress levels preslaughter. As well as the increased oxidative capacity of skeletal muscle to utilize fatty acids in ruminants could be particularly useful during metabolic states in which fatty acids are excessively mobilized from adipose tissue, such as in ketosis and/or fatty liver of high yielding dairy cows.

Nikotinsäure (NA) ist das älteste lipidsenkende Medikament und wird bereits seit mehr als fünf Jahrzehnten bei der Behandlung von Atherosklerose und Stoffwechselkrankheiten eingesetzt. Der lipidsenkende Effekt der Nikotinsäure wurde intensiv untersucht und ist gekennzeichnet durch einen antilipolytischen Effekt auf Adipozyten, der durch die Bindung an den Nikotinsäurerezeptor GpR109A vermittelt wird. Während der Langzeittherapie mit Nikotinsäure kommt es zu einem Rebound-Effekt mit überschießenden Konzentrationen an freien Fettsäuren im Plasma, wobei jedoch der lipidsenkende Effekt erhalten bleibt. Trotz der langen Historie der klinischen Verwendung, ist der genaue Mechanismus der lidpidsenkenden Wirkung noch nicht eindeutig geklärt. In diesem Zusammenhang soll die vorliegende Dissertation die Hypothese überprüfen, dass Nikotinsäure den Übergang von Typ-II-Muskelfasern zu Typ-I- Muskelfasern induziert und somit die oxidative Kapazität des Skelettmuskels erhöht, was einen zugrundeliegenen lipidsenkenden Mechanismus der Nikotinsäure darstellten könnte. Es ist bereits bekannt, dass die Supplementierung von Nikotinsäure der Adipositas-induzierten Muskelfaserumwandlung von oxidativen Typ-I Muskelfasern zu glykolytischen Typ-II Fasern entgegenwirkt und die Anzahl der Typ-I Muskelfasern im Skelettmuskel von adipösen Zucker-Ratten erhöht. Dieser Effekt wird wahrscheinlich über die Aktivierung der Hauptregulatoren der Muskelfaserumwandlung erreicht, zu denen der peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1α), der peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-beta (PGC-1β) und der peroxisome proliferator-activated receptor delta (PPARδ) gehören. Dessen Aktivierung führt zu einer Umwandlung von Typ-II Muskelfasern zu Typ-I Muskelfasern und einer Hochregulierung von Genen, die bei der Fettsäureoxidation, der oxidativen Phosphorylierung sowie der Angiogenese involviert sind. Das Ziel der vorliegenden Dissertation bestand darin, die Hypothese zu untersuchen, dass die Verabreichung von Nikotinsäure die Muskelfaserverteilung und den metabolischen Phänotyp ausgewählter Skelettmuskeln beim Schwein, als Model eines Nichtwiederkäuers (Studie 1), und beim Schaf (Studie 2), als Model eines Wiederkäuers, beeinflusst. Um die Hypothese der ersten Studie zu untersuchen, wurden 25 männliche Schweine im Alter von 11 Wochen und einem durchschnittlichen Körpergewicht von 32,8 ± 1,3 kg (Mittelwert ± SD) zufällig 2 Gruppen zugeordnet. Die 12 Schweine der Kontrollgruppe bekamen ein Kontrollfutter, während den 13 Schweinen der Behandlungsgruppe das Kontrollfutter mit Zusatz von 750 mg Nikotinsäure/kg Ration verabreicht wurde. Die Muskelfasertypisierung wurde mit Proben des M. longissimus dorsi (LD), M. quadriceps femoris (QF) und M. gastrognemicus (G) vorgenommen. Zusätzlich wurden quantitative PCR-Analysen mit LD-Proben durchgeführt. Durch die Gabe von Nikotinsäure erhöhte sich der prozentuale Anteil von Typ-I-Muskelfasern signifikant in allen ausgewählten Muskeln (LD, QF, G), während sich der prozentuale Anteil der Typ-II-Muskelfasern verringerte, im Vergleich mit der Kontrollgruppe. In Übereinstimmung dazu waren die relativen mRNA-Konzentrationen des Typ-I-spezifischen Gens myosin heavy chain, MYH7 im LD der Behandlungsgruppe tendenziell höher (P < 0.15) und die der Typ-II-spezifischen Gene MYH2 und MYH4 signifikant bzw. tendenziell (P < 0.15) vermindert, im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die relativen mRNA-Konzentrationen der Hauptregulatoren waren nach Behandlung mit Nikotinsäure im Falle von PGC1β signifikant erhöht und bei PGC1α numerisch erhöht. Für die Gene des mitochondrialen Fettsäurestoffwechsels [carnitine acylcarnitine translocase, fatty acid transport protein1, novel organic cation transporter 2, succinate dehydrogenase subunit A, (SDHA), cytochrome c oxidase 4/1 und 6A1, (COX4/1 und COX6A1) und der Thermogenese uncoupling proteins 3] konnte ein signifikanter Anstieg der relativen mRNA-Konzentrationen im LD in der Gruppe mit Nikotinsäuresupplementierung gezeigt werden. Zur Überprüfung der Hypothese der zweiten Studie wurde ein vierwöchiger Versuch mit 16 männlichen, 11 Wochen alten Rhönschafen durchgeführt, welche ein durchschnittliches Körpergewicht von 29,6 ± 3,0 kg (Mittelwert ± SD) hatten und zufällig der Kontrollgruppe (Kontrollration ohne Nikotinsäure) oder der Behandlungsgruppe (Kontrollration plus 1 g Nikotinsäure/Tag) zugeordnet wurden. Die vierwöchige Nikotinsäuresupplementierung der Schafe führte zu einer prozentualen Erhöhung der Typ-1-Muskelfasern in den ausgewählten Muskeln LD, M. semimebranosus (SM) und M. Semitendinosus (ST), wohingegen der prozentuale Anteil der Typ-II Muskelfasern im Vergleich zur Kontrollgruppe geringer war. Dieser Effekt äußerte sich auch in den erhöhten relativen mRNA-Konzentrationen der spezifischen myosin heavy chain, MHCI Isoform im Muskel SM und ST (P < 0.05) und LD (P < 0.15) sowie in den Transkriptleveln der MHCIIX-Isoform, die verringert waren in den Muskeln SM (P < 0.05) und LD (P < 0.15), verglichen mit der Kontrollgruppe. Auch die relativen mRNA-Konzentrationen der Hauptregulatoren der Muskelfaserumwandlung, PGC1alpha, PGC1ß und PPARδ, waren in den drei ausgewählten Muskeln signifikant oder tendenziell signifikant erhöht in der Gruppe mit Nikotinsäuresupplementierung. Darüber hinaus konnte auch ein Anstieg der Proteinkonzentration von PGC1α in den Muskeln LD und SM nach Gabe von Nikotinsäure mittels Western Blot Analysen nachgewiesen werden. Damit einhergehend zeigten die ausgewählten Gene des Fettsäurestoffwechsels und der Angiogenese (SDHA, carnitine palmitoyltransferase 1B, solute carrier family 25 member 20, COX5A, COX6A1 und vascular endothelial growth factor A) in allen drei Muskeln der Schafe der Niacingruppe erhöhte relative mRNA-Konzentrationen.Zusammenfassend bestätigt die vorliegende Dissertation, dass Nikotinsäure ursächlich für die Muskelfaserumwandlung von (schnellen-glykolytischen) Typ-II Fasern zu (langsamen-oxidativen) Typ-I Fasern ist und damit die oxidative Kapazität in den verschiedenen ausgewählten Muskeln von Schwein und Schaf erhöht. Diese gesteigerte oxidative Kapazität, die durch Nikotinsäure induziert wird, verbessert möglicherweise die Fleischqualität, da die oxidativen Muskelfasern aufgrund der intensiven körperlichen Aktivität und/oder des hohen psychischen Stresslevels unmittelbar vor der Schlachtung die Entstehung von dunklem, festem und trockenem Fleisch begünstigen. Die erhöhte oxidative Kapazität der Skelettmuskulatur könnte auch in Situationen, die mit einer erhöhten Stoffwechselrate assoziiert sind, wie zum Beispiel Ketose oder Fettleber bei der hochleistenden Milchkuh, vorteilhalt sein, da somit möglicherweise die Metabolisierung von Fettsäuren verbessert werden kann.