Alternative splicing regulation in the human system : mechanistic studies of hnRNP L and CA-rich elements

Abstract

Alternative splicing of pre-mRNAs is the major contributor in the human system to generate complex proteomes from a comparatively low number of genes. Several modes of alternative splicing are known today which are tightly regulated to ensure accurate protein expression. We have identified intronic CA repeat and CA-rich sequences as a new class of regulatory elements acting as enhancers or silencers on alternative splicing. Their function is mediated by the heterogenous ribonucleoprotein (hnRNP) L which has been characterised as the main CA binding protein. Considering that CA repetitive sequences are very common in the human genome, the identification and analysis of hnRNP L target genes should give further insights into the mechanism of alternative splicing regulation. In this work, I studied alternative splicing regulation of three recently identified hnRNP L target genes. First, in the SLC2A2 gene CA repeats were identified as an intronic splicing silencer element. Their function was shown to depend on hnRNP L as the trans-acting factor. Further studies on the mechanism of splicing regulation demonstrated that hnRNP L interfered with 5 splice site recognition by the U1 snRNP. Second, I characterised a short intronic CA-rich cluster in the TJP1 gene as an hnRNP L-dependent splicing silencer. In contrast to SLC2A2, hnRNP L was shown to compete with U2AF65 for binding to the polypyrimidine tract thus impairing 3 splice site recognition. Third, an intronic CA repeat in the ITGA2 gene either activated splicing of the corresponding exon or repressed recognition of a cryptic exon in a sequence-dependent manner. Furthermore, a combined microarray and RNAi analysis revealed new modes of hnRNP L-mediated splicing regulation and, moreover, a novel role for hnRNP L in alternative polyadenylation. In the ASAH1 gene, hnRNP L repressed usage of an internal poly(A) site. Taken together, I have studied different mechanism of splicing regulation on the basis of three genes, SLC2A2, TJP1, and ITGA2. The results revealed new functions of CA repeat and CA-rich sequences and hnRNP L in alternative splicing regulation. In sum, hnRNP L was shown to be a global and versatile regulator protein in the human system with roles in alterative splicing and polyadenylation. Alternatives Spleißen von prä-mRNAs trägt hauptsächlich dazu bei, aus einer verhältnismäßig kleinen Anzahl von Genen ein komplexes Proteom zu erzeugen. Es sind verschiedene Formen des alternativen Spleißens bekannt, die streng reguliert werden müssen, um eine fehlerfreie Expression von Proteinen zu gewährleisten. Repetitive CA-Sequenzen bilden eine neue Gruppe spleißregulatorischer Sequenzelemente. CA-Dinukleotidwiederholungen sowie CA-reiche Sequenzen können als Spleiß-Enhancer oder Silencer auf alternative Spleißvorgänge wirken. HnRNP L gehört zur großen Gruppe der heterogenen nukleären Ribonukleoproteine (hnRNPs) und bindet CA repetitive Sequencen mit hoher Affinität. Die Identifizierung von Genen, deren alternatives Spleißen durch hnRNP L reguliert wird, soll dazu beitragen, weitere Erkenntnisse über den Regulationsmechanismus alternativer Spleißvorgänge zu gewinnen. Die Regulation von alternativen Spleißvorgängen wurde in dieser Arbeit anhand von drei ausgewählten Beispielen untersucht. Im Gen SLC2A2 wurden CA-Dinucleotidwiederholungen als intonischer Spleiß-Silencer identifiziert, dessen Funktion von hnRNP L als trans-agierenden Faktor abhängt. Weitergehende Studien zum Mechanismus der Spleißregulation zeigten, dass hnRNP L mit der Erkennung der 5 Spleißstelle durch den U1 snRNP interferiert. Eine kurze intronische CA-reiche Sequenz im TJP1 Gen konnte als Spleiß-Silencer charakterisiert werden, dessen Funktion ebenfalls von hnRNP L vermittelt wird. Im Gegensatz zu SLC2A2, konnte für TJP1 gezeigt werden, dass hnRNP L mit U2AF65 um die Bindung zum Polypyrimidine Trakt konkurriert. Für einen CA-reichen Abschnitt im ersten Intron des ITGA2 Gens wurde gezeigt, dass dieser, abhängig von der Sequenz des gesamten Introns, entweder die Benutzung der nahe liegenden 5 Spleißstelle aktiviert oder die Erkennung eines kryptischen Exons unterdrückt. Darüber hinaus konnte mit Hilfe einer Untersuchung, kombiniert aus Microarray und RNAi, eine neue Funktion von hnRNP L identifiziert werden, nämlich die Beteiligung an alternativer Polyadenylierung. Für das Gen ASAH1 wurde gezeigt, dass hnRNP L die Verwendung einer internen Polyadenylierungsstelle verhindert. Zusammenfassend ist zu sagen, dass die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit neue Einblicke in den Mechanismus der Regulation von alternativen Spleißen durch hnRNP L erlauben. Zudem konnte hnRNP L eine Beteiligung an der Auswahl alternativer Poly(A)-Stellen nachgewiesen werden. Im humanen System bildet hnRNP L damit ein vielseitiges Regulationsprotein.