Untersuchungen zur Regulation des Ubiquitin-Proteasom-Systems durch den Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktor und dessen Interaktoren COP9 Signalosom und p97 in der zellulären Hypoxieantwort
Der Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktor (MIF) ist ein ubiquitär vorkommendes Zytokin mit vielfältigen biologischen Funktionen. MIF spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese zahlreicher chronisch-entzündlicher sowie onkologischer Erkrankungen. Es ist weiterhin bekannt, dass MIF über eine Interaktion mit CSN5, einer katalytischen Untereinheit des CSN-Komplexes (auch Signalosom genannt), die Funktion von Cullin-Ring-Ligasen im Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) beeinflussen kann, indem es die Deneddylase-Aktivität von CSN5 inhibiert. Auf der Suche nach neuen Interaktionspartnern von MIF wurde auch die ATPase p97 als neuer, indirekter Interaktionspartner identifiziert. p97 spielt eine große Rolle bei einer Reihe intrazellulärer Aktivitäten. So ist es in seiner Funktion als Chaperon an der Entfaltung und am Abbau von den im endoplasmatischen Retikulum fehlgefalteten, aber auch löslichen zytosolischen Proteinen (z.B. auch HIF-1alpha) beteiligt. Daraus entstand die Hypothese, das möglicherweise p97 und CSN5 direkt miteinander interagieren.Das erste Ziel dieser Arbeit war es daher, die Beteiligung des gesamten CSN-Komplexes an der Interaktion mit dem p97-Homohexamer nachzuweisen sowie die Interaktion zwischen p97 und CSN5 näher zu untersuchen. Zunächst wurde die Ko-Fraktionierung der Komplexe mittels Glycerol-Dichtegradientenzentrifugation, Immunopräzipitation der Zielproteine und Western Blot analysiert. Im Immunoblot konnte gezeigt werden, dass sowohl p97 als auch CSN5 mit CSN1, einer weiteren Untereinheit des Signalosoms, kopräzipitiert wurden. Zusätzlich wurde die Interaktion beider Komplexe mittels nativer Kompositgelelektrophorese untersucht. Hier zeigte der Immunoblot, dass sich bei der Inkubation beider Komplexe nur in Anwesenheit von ATP ein hochmolekularer Komplex bildete, in dem CSN und p97 nachgewiesen werden konnten. Weiterhin wurden die an der Interaktion mit CSN5 beteiligten Domänen von p97 näher untersucht. Hierfür wurden HEK293T-Zellen mit Deletionskonstrukten der einzelnen p97-Domänen transfiziert, um mit Hilfe von Immunopräzipitation der exprimierten Proteine die Interaktion mit CSN5 zu charakterisieren. Das Ergebnis ließ den Schluss zu, dass sich sowohl die N-terminale Domäne als auch beide ATPase-Domänen an der Bindung des Signalosoms beteiligen.Der zweite Abschnitt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Funktion eines Komplexes aus p97 und CSN sowie der Rolle von MIF. Hierfür wurde das Mausmodell einer Kollagen-induzierten Arthritis sowie ein spezifischer MIF-Inhibitor, MIF098, verwendet. Untersucht wurden Stabilität und Funktion des Transkriptionsfaktors HIF-1alpha, der sowohl mit CSN als auch mit p97 interagiert. In den entzündeten Gelenken der in drei experimentellen Gruppen eingeteilten Tiere zeigte sich eine signifikante Abnahme der HIF-1alpha-Proteinkonzentration und der VEGF-A-mRNA-Expression in der mit dem MIF-Inhibitor behandelten Gruppe, wobei die Expression von HIF-1alpha-mRNA unbeeinflusst blieb. Die Ergebnisse zeigen, dass p97 und CSN ATP-abhängig einen hochmolekularen Komplex bilden, der sich vermutlich am proteasomalen Abbau des gemeinsamen Substrates, HIF-1alpha, beteiligt. Dabei könnte die Interaktion dieses Komplexes mit der HIF-1alpha-spezifischen E3-Ubiquitinligase einen molekularen Schalter darstellen, welcher durch MIF blockiert werden könnte, um die Degradierung von HIF-1alpha im UPS zu hemmen.
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