Untersuchungen zur Regulation des Ubiquitin-Proteasom-Systems durch den Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktor und dessen Interaktoren COP9 Signalosom und p97 in der zellulären Hypoxieantwort

Abstract

Der Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktor (MIF) ist ein ubiquitär vorkommendes Zytokin mit vielfältigen biologischen Funktionen. MIF spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese zahlreicher chronisch-entzündlicher sowie onkologischer Erkrankungen. Es ist weiterhin bekannt, dass MIF über eine Interaktion mit CSN5, einer katalytischen Untereinheit des CSN-Komplexes (auch Signalosom genannt), die Funktion von Cullin-Ring-Ligasen im Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) beeinflussen kann, indem es die Deneddylase-Aktivität von CSN5 inhibiert. Auf der Suche nach neuen Interaktionspartnern von MIF wurde auch die ATPase p97 als neuer, indirekter Interaktionspartner identifiziert. p97 spielt eine große Rolle bei einer Reihe intrazellulärer Aktivitäten. So ist es in seiner Funktion als Chaperon an der Entfaltung und am Abbau von den im endoplasmatischen Retikulum fehlgefalteten, aber auch löslichen zytosolischen Proteinen (z.B. auch HIF-1alpha) beteiligt. Daraus entstand die Hypothese, das möglicherweise p97 und CSN5 direkt miteinander interagieren.Das erste Ziel dieser Arbeit war es daher, die Beteiligung des gesamten CSN-Komplexes an der Interaktion mit dem p97-Homohexamer nachzuweisen sowie die Interaktion zwischen p97 und CSN5 näher zu untersuchen. Zunächst wurde die Ko-Fraktionierung der Komplexe mittels Glycerol-Dichtegradientenzentrifugation, Immunopräzipitation der Zielproteine und Western Blot analysiert. Im Immunoblot konnte gezeigt werden, dass sowohl p97 als auch CSN5 mit CSN1, einer weiteren Untereinheit des Signalosoms, kopräzipitiert wurden. Zusätzlich wurde die Interaktion beider Komplexe mittels nativer Kompositgelelektrophorese untersucht. Hier zeigte der Immunoblot, dass sich bei der Inkubation beider Komplexe nur in Anwesenheit von ATP ein hochmolekularer Komplex bildete, in dem CSN und p97 nachgewiesen werden konnten. Weiterhin wurden die an der Interaktion mit CSN5 beteiligten Domänen von p97 näher untersucht. Hierfür wurden HEK293T-Zellen mit Deletionskonstrukten der einzelnen p97-Domänen transfiziert, um mit Hilfe von Immunopräzipitation der exprimierten Proteine die Interaktion mit CSN5 zu charakterisieren. Das Ergebnis ließ den Schluss zu, dass sich sowohl die N-terminale Domäne als auch beide ATPase-Domänen an der Bindung des Signalosoms beteiligen.Der zweite Abschnitt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Funktion eines Komplexes aus p97 und CSN sowie der Rolle von MIF. Hierfür wurde das Mausmodell einer Kollagen-induzierten Arthritis sowie ein spezifischer MIF-Inhibitor, MIF098, verwendet. Untersucht wurden Stabilität und Funktion des Transkriptionsfaktors HIF-1alpha, der sowohl mit CSN als auch mit p97 interagiert. In den entzündeten Gelenken der in drei experimentellen Gruppen eingeteilten Tiere zeigte sich eine signifikante Abnahme der HIF-1alpha-Proteinkonzentration und der VEGF-A-mRNA-Expression in der mit dem MIF-Inhibitor behandelten Gruppe, wobei die Expression von HIF-1alpha-mRNA unbeeinflusst blieb. Die Ergebnisse zeigen, dass p97 und CSN ATP-abhängig einen hochmolekularen Komplex bilden, der sich vermutlich am proteasomalen Abbau des gemeinsamen Substrates, HIF-1alpha, beteiligt. Dabei könnte die Interaktion dieses Komplexes mit der HIF-1alpha-spezifischen E3-Ubiquitinligase einen molekularen Schalter darstellen, welcher durch MIF blockiert werden könnte, um die Degradierung von HIF-1alpha im UPS zu hemmen.

Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) is an abundant cytokine known to be involved in a variety of biological functions. It plays an important role in the pathogenesis of multiple systemic inflammatory disorders as well as in several cancer diseases. MIF is known for interacting with CSN5, a catalytic component of the CSN complex (Signalosome), thus modulating the functions of cullin-ring ligases within the ubiquitin-proteasome-system (UPS). This is mediated through inhibition of the deneddylase activity of CSN5. A systematic interactome screen revealed the ATPase p97 as an indirect interaction partner of MIF. The homohexameric p97 plays a pivotal role in several intracellular processes. For instance, it functions as a chaperone in processes such as protein turnover and proteasomal degradation of factors such as HIF-1alpha. This prompted the hypothesis that p97 and CSN5 may be direct interaction partners. Thus, the first goal of this study was to show the interaction between the entire CSN complex and the homohexameric p97 as well as to further characterize the interaction between p97 and CSN5. Initially, co-fractionation of the two complexes was analyzed using density gradient centrifugation, immunoprecipitation and immunoblotting. As a result, p97 as well as CSN5 co-precipitated with CSN1, another subunit of the signalosome. Additionally, the interaction of both protein complexes was verified using a discontinuous native gel electrophoresis in a composite gradient gel system. Here, the incubation of both complexes showed the formation of a high molecular weight structure which included both, CSN and p97. This association occurred only in the presence of ATP. To map the binding interface between p97 and CSN5, deletion constructs were used in HEK293T cells. The immunoprecipitation of the expressed proteins revealed that both, the N-terminal domain and the ATPase domains of the p97 are required for the interaction with the signalosome. The second part of this study mainly focused on the function of the p97-CSN complex and the role of MIF in this context. Therefore, a specific MIF-inhibitor (MIF098) was used in an animal model of a collagen-induced arthritis. Here, the goal was to evaluate the stability and function of HIF-1alpha, a transcription factor known to interact with both CSN and p97. As a result, a significant decrease of the protein concentration of HIF-1alpha as well as a decrease of the VEGF-A-mRNA expression was observed in the inflamed joint tissue of animals treated with MIF098. At the same time, no alteration of the HIF-1alpha-mRNA expression was observed. In summary, this study demonstrates the ATP-dependent association of a high molecular complex containing p97 and CSN. This complex appears to be involved in the proteasomal degradation of HIF-1alpha, a known substrate of both p97 and CSN. Specifically, the interaction of the p97-CSN-complex with the HIF-1alpha-specific E3-ubiquitin ligase could represent a molecular switch, which once blocked by MIF is able to prevent the degradation of HIF-1alpha within the UPS.