Quantifizierung der DNA von Verticillium dahliae in planta mittels kompetitiver PCR und HPLC

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2002

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-17047

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Da die sehr geringe Biomasse des Welkeerregers Verticillium dahliae in der Frühphase der Pathogenese in jungen Tomatenpflanzen mitELISA nicht quantifiziert werden kann, wurde die Möglichkeit einer molekularbiologischen Analyse geprüft. Dabei wurden folgendeErgebnisse erzielt. - Anhand der DNA-Sequenzen von 9 verschiedenen Verticillium spp. wurden aus dem ITS1 ein 22mer 'upstream' Primer (VdP1) und ausdem ITS2 ein 20mer 'downstream' Primer (VdP2) konstruiert. - In einer spezifischen PCR mit den beiden Primern und einer Annealingtemperatur von 62°C erfolgt eine Amplifikation der V.dahliae-DNA. Unter den gleichen Bedingungen wurde die DNA von V. albo-atrum, V. lecanii, V. nigrescens und V. tricorpus nichtamplifiziert. - Für eine Effizienzkontrolle der PCR wurde mittels eines '3´ linker primer' ein interner Standard (FIS) konstruiert. Dabei wurde dasamplifizierte 332bp des 5.8S rRNA Gens von V. dahliae zu einer DNA-Matrix von 252bp verkürzt. - Es wurden die Bedingungen für eine Koamplifikation von V. dahliae- DNA und FIS ermittelt, der Voraussetzung für eine kompetitive PCR. - Um die Amplifikate quantifizieren zu können wurde ein Protokoll für eine HPLC-Analyse erstellt. - Mit 0.25, 2.5 oder 25 pg FIS pro PCR-Ansatz und ausschließender Quantifizierung der Amplifikate durch HPLC kann V. dahliae-DNA inlinearer Beziehung in Mengen zwischen 0.0001 bis 10 ng sicher bestimmt werden. - Nach künstlicher Inokulation stieg die V. dahliae-DNA in den Wurzeln des anfälligen Tomaten cv. Planet in der Periode 4- 14 dpi auf1.0-1.5 µg / g Trockengewicht. Bei drei resistenten Tomatensorten war ein entsprechender Anstieg nicht erkennbar. - Im ersten Blatt des anfälligen cv. Planet war der Welkeerreger ab 6 dpi deutlich vorhanden. Bei drei resistenten Tomatensorten waren,wenn überhaupt, nur Spuren von V. dahliae nachzuweisen. Mit einer kompetitiven PCR und HPLC-Analyse der Amplifikate können sehr geringe Mengen von V. dahliae-DNA in planta gemessenwerden, die mit ELISA nicht quantifiziert werden können. Dieses neu entwickelte und hoch empfindliche Verfahren kann in derResistenzzüchtung, der Epidemiologie und Untersuchungen zur Pathogenese genutzt werden.

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