Quantifizierung der DNA von Verticillium dahliae in planta mittels kompetitiver PCR und HPLC

Abstract

Da die sehr geringe Biomasse des Welkeerregers Verticillium dahliae in der Frühphase der Pathogenese in jungen Tomatenpflanzen mitELISA nicht quantifiziert werden kann, wurde die Möglichkeit einer molekularbiologischen Analyse geprüft. Dabei wurden folgendeErgebnisse erzielt. - Anhand der DNA-Sequenzen von 9 verschiedenen Verticillium spp. wurden aus dem ITS1 ein 22mer 'upstream' Primer (VdP1) und ausdem ITS2 ein 20mer 'downstream' Primer (VdP2) konstruiert. - In einer spezifischen PCR mit den beiden Primern und einer Annealingtemperatur von 62°C erfolgt eine Amplifikation der V.dahliae-DNA. Unter den gleichen Bedingungen wurde die DNA von V. albo-atrum, V. lecanii, V. nigrescens und V. tricorpus nichtamplifiziert. - Für eine Effizienzkontrolle der PCR wurde mittels eines '3´ linker primer' ein interner Standard (FIS) konstruiert. Dabei wurde dasamplifizierte 332bp des 5.8S rRNA Gens von V. dahliae zu einer DNA-Matrix von 252bp verkürzt. - Es wurden die Bedingungen für eine Koamplifikation von V. dahliae- DNA und FIS ermittelt, der Voraussetzung für eine kompetitive PCR. - Um die Amplifikate quantifizieren zu können wurde ein Protokoll für eine HPLC-Analyse erstellt. - Mit 0.25, 2.5 oder 25 pg FIS pro PCR-Ansatz und ausschließender Quantifizierung der Amplifikate durch HPLC kann V. dahliae-DNA inlinearer Beziehung in Mengen zwischen 0.0001 bis 10 ng sicher bestimmt werden. - Nach künstlicher Inokulation stieg die V. dahliae-DNA in den Wurzeln des anfälligen Tomaten cv. Planet in der Periode 4- 14 dpi auf1.0-1.5 µg / g Trockengewicht. Bei drei resistenten Tomatensorten war ein entsprechender Anstieg nicht erkennbar. - Im ersten Blatt des anfälligen cv. Planet war der Welkeerreger ab 6 dpi deutlich vorhanden. Bei drei resistenten Tomatensorten waren,wenn überhaupt, nur Spuren von V. dahliae nachzuweisen. Mit einer kompetitiven PCR und HPLC-Analyse der Amplifikate können sehr geringe Mengen von V. dahliae-DNA in planta gemessenwerden, die mit ELISA nicht quantifiziert werden können. Dieses neu entwickelte und hoch empfindliche Verfahren kann in derResistenzzüchtung, der Epidemiologie und Untersuchungen zur Pathogenese genutzt werden.

The very small biomass of V. dahliae in the early phase of pathogenesis in young tomato seedlings can not be quantified with ELISA. Thus,the possibility of a molecular biological analysis was tested with the following results. Based on the DNA-sequences of 9 different Verticillium spp. A 22mer upstream primer (VdP1) was constructed from the ITS1 and a20mer downstream primer (VdP2) from the ITS2. - In a specific PCR with the two primers and an annealing temperature of 62°C the V.dahliae-DNA was amplified, while there was noamplification with V. albo-atrum, V. lecanii, V. nigrescens and V. tricorpus. - For an efficiency control of the PCR, an internal standard (FIS) was constructed, employing a 3´linker primer. Thereby, the amplified 332bp of the 5.8S rRNA gene of V. dahliae was converted into a shorter DNA-template of 252 bp. - The conditions for a coamplification of V. dahliae-DNA and FIS were determined, the prerequisite for a competitive PCR. - A HPLC protocoll was developed for a quantification of the amplified products. - With 0.25, 2.5 or 25 pg FIS in the PCR-probes and subsequent quantification of the amplified products by HPLC V. dahliae-DNA can bemeasured in a linear relation between 0.0001 to 10ng. - After artificial inoculation of the susceptible tomato cv. Planet, the V. dahliae-DNA in the roots rose to 1.0 - 1.5 µg / g dry weight in theperiod 4 -14 dpi. With the three resistant tomato cultivars there was no such an increase. - In the first leaf of the susceptible cv. Planet the wilt pathogen was clearly present 6 dpi. With the three resistant tomato cultivars thepathogen was, if at all, only detectable in traces. With a competitive PCR and a HPLC-analysis of the amplified products very small quantities of V. dahliae-DNA can be measured inplanta. This new developed and very sensitive analytical tool can be utilized in resistance breeding, epidemiology and studies on thepathogenesis.