Analyse der Interaktion von microRNA-122-Protein-Komplexen mit der NS5B-kodierenden Region und der 3´-untranslatierten Region der Hepatitis C Virus-RNA
Das Hepatitis C Virus besitzt ein einzelsträngiges, positiv orientiertes RNA-Genom und ist der Familie der Flaviviridae zugeordnet. Aufgrund der positiven Orientierung kann das Genom nach der Infektion von Hepatozyten direkt dem Translationsapparat der Zelle zur Verfügung gestellt werden. Das 9600 Nukleotide umfassende Genom besitzt einen offenen Leserahmen (ORF), welcher für ein einziges Polyprotein kodiert. Nach erfolgter co- und posttranslationaler Prozessierung entstehen die reifen Genprodukte. Flankiert wird der ORF von zwei untranslatierten Regionen (UTRs), der 5´- und der 3´-UTR, welche die cis-Signale für die Translation und Replikation der viralen RNA beinhalten. Die 5´-UTR bildet eine hochkonservierte Sekundärstruktur aus, die sogenannte interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), welche eine cap-unabhängige Translation ermöglicht. Weiterhin besitzt die HCV-RNA verschiedene Erkennungssequenzen für die leberspezifische microRNA-122 (miR-122). Zwei dieser hochkonservierten Sequenzen befinden sich in der 5´-UTR, welche durch eine Adressierung der miR-122, gebunden an das Argonaute2-Protein (Ago2), zu einer Verstärkung der RNA-Replikation und Translation so wie zu einer Stabilisierung der RNA führt. Eine weitere miR-122-Bindungsstelle befindet sich in der variablen Region der 3´-UTR, von der berichtet wird, dass eine miR-122-Bindung keinen Einfluss auf die Translation hat. Außerdem befinden sich noch zwei hochkonservierte Erkennungssequenzen in der Nicht-Struktur-Protein 5B (NS5B)-kodierenden Region des HCV-Genoms.Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Interaktion von miR-122/Ago2-Komplexen mit der NS5B-kodierenden Region und der 3´-UTR der Hepatitis C Virus-RNA. Es konnte durch co-Immunopräzipitationen gezeigt werden, dass der miR-122/Ago2-Komplex an die drei Erkennungssequenzen in der NS5B-Region und der 3´-UTR hybridisiert. Die Stärke der Bindung hängt jedoch sowohl vom verwendeten Genotypen ab, als auch davon, wie zugänglich die jeweilige Erkennungssequenz für den Komplex vorliegt. Zusätzlich konnte noch die in der Arbeitsgruppe Niepmann aufgestellte Theorie, dass eine Bindung der miR-122 an ihre seed-target-Sequenz in der 3´-UTR der HCV-RNA nur in Kombination mit einer zusätzlichen 4 Nukleotide langen Sequenz (supplemental-Region) möglich ist, widerlegt werden. Für eine Hybridisierung des miR-122/Ago2-Komplexes an die 3´-UTR genügt die seed-target Sequenz. Außerdem konnte die Bindung durch das Einbringen von Mutationen in allen drei Erkennungssequenzen unterbunden werden. Des Weiteren konnte durch die Verwendung von HCV-Reporter-Konstrukten gezeigt werden, dass die Hybridisierung des miR-122/Ago2-Komplexes an die 3´-UTR zu einer Reduktion der Translation führt, dies jedoch nur in Kombination mit einer miR-122-Bindung an die 5´-UTR. Diese Ergebnisse sind Voraussetzung für die weitergehende Untersuchung der Rolle dieser miR-122-Bindungsstellen im HCV-Replikationszyklus.
Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
